本文系作者張瓊懂三農原創，未經允許禁止轉載。
孢子分離法是指在無菌條件下，使食用菌的孢子在適宜培養基上萌發成菌絲體，再經過栽培試驗篩選比較，獲得性狀優良、能用於栽培的純菌種。孢子分離法主要是對擔孢子或子囊孢子進行分離，而擔孢子和子囊孢子均是有性繁殖產生的產物，多數為單核或多核的單倍體，一般可供雜交育種，但通常孢子萌發的菌絲不能直接用於生產。少數擔孢子萌發形成異核體菌絲，可以形成子實體，但這些擔孢子萌發獲得的純培養物，必須經過栽培試驗篩選方能在生產中使用。孢子分離法過程較煩瑣，工作量大，所需時間長，且必須通過出菇試驗才能篩選出好的菌種。孢子分離法可分為單孢分離法和多孢分離法。
（一）孢子採集
選擇出菇早、性狀典型、生長健壯、成熟度適宜的優良個體作為種菇，最好是第一潮或第二潮菇。雙孢蘑菇、草菇等應採摘菌膜即將開裂的子實體，香菇、平菇等則應採摘菇體八成熟即將釋放孢子的子實體。種菇選定後，用無菌水清洗菇體表面，晾乾，切去多餘菌柄，僅留下1.5~2.0cm。常見孢子採集方法如下。
1.孢子採集器收集、孢子採集器由玻璃罩（頂部有孔）、搪瓷盤、培養皿、金屬支架（插種菇用）和紗布等組成。在搪瓷盤內墊幾層紗布，上面放置一個直徑為70~90mm的培養皿，其內放入金屬支架，培養皿外加蓋玻璃罩，玻璃罩頂部孔口用棉塞塞好。將組裝好的孢子採集器用雙層紗布包起來，經高壓滅菌後備用。孢子收集可在接種箱或超淨工作檯上進行。用75％的酒精棉球對種菇進行表面消毒，再用無菌水衝洗3次，無菌紗布吸乾表面水分。用鑷子夾住種菇菌柄，使菌褶向下插於孢子採集器的金屬支架上，蓋上玻璃罩。為了滿足種菇開傘彈射孢子時的溼度要求，同時防止雜菌侵入，可在搪瓷盤中的紗布上倒少量無菌水，然後將孢子採集器置於適溫下（16-28℃）促進孢子彈射，經1-2d，即可在培養皿中看到落下的孢子印。在無菌條件下，將種菇連同金屬支架一起拿掉，蓋好培養皿，用透明膠帶封上或用紙包紮好備用；若長期保存，可放入冰箱內冷藏。
2.三角瓶鉤懸法多用於銀耳、先準備好已滅菌的裝有約1cm厚固體培養基的三角瓶以及金屬鉤。選取新鮮成熟的耳片，削去耳根及基質碎屑。在無菌操作臺上，用無菌水反覆衝洗耳片，然後切取肥厚的耳片部位，放入燒杯內，用無菌水再衝洗數次，無菌紗布或吸水紙吸表面水分將處理好的耳片取一小塊孕面朝下鉤在金屬鉤上，懸掛於三角瓶內，塞上棉塞。在2325℃條件下培養1-2d.孢子會落在培養基上。無菌條件下，取出金屬鉤與耳片，塞上棉塞保存備用。
（二）多孢分離
多孢分離法是將多個孢子接種在同一培養基上使其萌發，隨機自由交配，從而獲得純菌種的方法。包括斜面劃線法和塗布分離法。1.斜面劃線法在無菌條件下，用接種環蘸取少量的孢子，在斜面培養基上自下面上輕輕劃線避免劃破培養基表面；接種完畢，灼燒試管口，塞上棉塞，25℃恆溫培養；待孢子萌發出菌絲，並自由配對結合後，挑選長勢旺的菌落，轉接於新的試管斜面上繼續培養，即可得到純菌種。
2.塗布分離法按照無菌操作要求，用接種環蘸取少量的孢子，放入裝有無菌水的三角瓶中，充分搖勻，製成孢子懸浮液；吸取孢子懸浮液，滴1-2滴於斜面或平板培養基上，轉動試管或培養皿使懸浮液均勻分布於培養基表面，或用接種環將培養基上的懸浮液塗布均勻。25℃恆溫培養，挑選長勢健壯、生長較快的菌落，移接於斜面培養基上培養，即可得到純菌種。上述兩種方法得到的純菌種，必須進行出菇試驗，從出菇的群體中選擇優良個體，進行組織分離，方能獲得在栽培生產中使用的菌種。
（三）單孢分離
單孢分離法是在採集到大量孢子的基礎上，經過稀釋，使孢子之間互相分開，各個孢子單獨萌發出菌絲。單孢分離方法包括玻片稀釋分離法和平板稀釋分離法。同宗結合的食用菌而言，單孢分離獲得的純菌種具有結實性，但單孢菌株群體性狀分化較大，必須經過出菇試驗後，才能挑選優良個體進行組織分離，獲得可用於生產的純菌種；對異宗結合的食用菌而言，由單個孢子發育而來的單核菌絲僅能作為雜交育種的試驗材料，絕對不能製備菌種用於栽培生產。