甘油冷凍保藏法
本方法適合於中、長期菌種保藏,保藏時間一般為2-4年左右.
(1)用火焰滅菌的接種環取斜面菌種在平皿上劃線分離單菌落.
(2)平皿倒置於30℃或37℃恆溫培養箱,培養24-48小時,至單菌落的大小為3mm左右.
(3)挑取一個單菌落,接種於一個裝50mL的300mL三角瓶中30℃或37℃振蕩培養10-15小時,至菌密度OD600為1.0-1.5.
(4)用火焰滅菌的接種環取少量種子液,塗片後,作革蘭氏染色,在顯微鏡下觀察菌體的形態,及是否有雜菌.
(5)按30%甘油:種子液為1:1(V/V)的量加入無菌甘油, 混合後分裝至事先滅菌的菌種保存管(1-2mL/管),-70℃或液氮保存.
冷凍乾燥保藏法
(1)準備安瓿管用於冷凍乾燥菌種保藏的安瓿管宜採用中性玻璃製造,形狀可用長頸球形底的,亦稱淚滴型安瓿管,大小要求外徑6-7.5mm,長105mm,球部直徑9-11mm,壁厚0.6-1.2mm.也可用沒有球部的管狀安瓿管.塞好棉塞,1.05kg/cm2,121.3℃滅菌30分鐘,備用.
(2)準備菌種,用冷凍乾燥法保藏的菌種,其保藏期可達數年至十數年,為了在許多年後不出差錯,故所用菌種要特別注意其純度,即不能有雜菌汙染,然後在最適培養基中用最適溫度培養,使培養出良好的培養物.細菌和酵母的菌齡要求超過對數生長期,若用對數生長期的菌種進行保藏,其存活率反而降低.一般,細菌要求24—48小時的培養物;酵母需培養3天;形成孢子的微生物則宜保存孢子;放線菌與絲狀真菌則培養7-10天.
(3)製備菌懸液與分裝以細菌斜面為例,用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中,製成濃菌液,每支安瓿管分裝0.2ml.
(4)冷凍冷凍乾燥器有成套的裝置出售,價值昂貴,此處介紹的是簡易方法與裝置,可達到同樣的目的.
將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍,無低溫冰箱可用冷凍劑如乾冰(固體CO2)酒精液或乾冰丙酮液,溫度可達-70℃.將安瓿管插入冷凍劑,只需冷凍4-5分鐘,即可使懸液結冰.
(5)真空乾燥為在真空乾燥時使樣品保持凍結狀態,需準備冷凍槽,槽內放碎冰塊與食鹽,混合均勻,可冷至-15℃.裝置儀器,安瓿管放入冷凍槽中的乾燥瓶內.
抽氣一般若在30分鐘內能達到93.3Pa(0.7mmHg)真空度時,則乾燥物不致熔化,以後再繼續抽氣,幾小時內,肉眼可觀察到被乾燥物已趨乾燥,一般抽到真空度26.7Pa(0.2mmHg),保持壓力6-8小時即可.
(6)封口抽真空乾燥後,取出安瓿管,接在封口用的玻璃管上,可用L形五通管繼續抽氣,約10分鐘即可達到26.7Pa(0.2mmHg).於真空狀態下,以煤氣噴燈的細火焰在安瓿管頸中央進行封口.封口以後,保存於冰箱或室溫暗處.
此法為菌種保藏方法中最有效的方法之一,對一般生活力強的微生物及其孢子以及無芽胞菌都適用,即使對一些很難保存的致病菌,如腦膜炎球菌與淋病球菌等亦能保存.適用於菌種長期保存,一般可保存數年至十餘年,但設備和操作都比較複雜。
濾紙保藏法
(1)將濾紙剪成0.5×1.2cm的小條,裝入0．6×8cm的安瓿管中,每管1-2張,塞以棉塞,1.05kg/cm2,121.3℃滅菌30分鐘。
(2)將需要保存的菌種,在適宜的斜面培養基上培養,使充分生長。
(3)取滅菌脫脂牛乳1-2ml滴加在滅菌培養皿或試管內,取數環菌苔在牛乳內混勻,製成濃懸液。
(4)用滅菌鑷子自安瓿管取濾紙條浸入菌懸液內,使其吸飽,再放回至安瓿管中,塞上棉塞。
(5)將安瓿管放入內有五氧化二磷作吸水劑的乾燥器中,用真空泵抽氣至幹。
(6)將棉花塞入管內,用火焰熔封,保存於低溫下。
(7)需要使用菌種,復活培養時,可將安瓿管口在火焰上燒熱,滴一滴冷水在燒熱的部位,使玻璃破裂,再用鑷子敲掉口端的玻璃,待安瓿管開啟後,取出濾紙,放入液體培養基內,置溫箱中培養。
細菌、酵母菌、絲狀真菌均可用此法保藏,前兩者可保藏2年左右,有些絲狀真菌甚至可保藏14-17年之久.此法較液氮、冷凍乾燥法簡便,不需要特殊設備.
沙土保藏法
(1)取河沙加入10％稀鹽酸,加熱煮沸30分鐘,以去除其中的有機質.
(2)倒去酸水,用自來水衝洗至中性。
(3)烘乾,用40目篩子過篩,以去掉粗顆粒,備用。
(4)另取非耕作層的不含腐植質的瘦黃土或紅土,加自來水浸泡洗滌數次,直至中性。
(5)烘乾,碾碎,通過100目篩子過篩,以去除粗顆粒。
(6)按一份黃土、三份沙的比例(或根據需要而用其他比例,甚至可全部用沙或全部用土)摻合均勻,裝入10×100mm的小試管或安瓿管中,每管裝1g左右,塞上棉塞,進行滅菌,烘乾。
(7)抽樣進行無菌檢查,每10支沙土管抽一支,將沙土倒入肉湯培養基中,37℃培養48小時,若仍有雜菌,則需全部重新滅菌,再作無菌試驗,直至證明無菌,方可備用。
(8)選擇培養成熟的(一般指孢子層生長豐滿的,營養細胞用此法效果不好)優良菌種,以無菌水洗下,製成孢子懸液。
(9)於每支沙土管中加入約0.5ml(一般以剛剛使沙土潤溼為宜)孢子懸液,以接種針拌勻。
(10)放入真空乾燥器內,用真空泵抽乾水分,抽乾時間越短越好,務使在12小時內抽乾。
(11)每10支抽取一支,用接種環取出少數沙粒,接種於斜面培養基上,進行培養,觀察生長情況和有無雜菌生長,如出現雜菌或菌落數很少或根本不長,則說明製作的沙土管有問題,尚須進一步抽樣檢查。
(12)若經檢查沒有問題,用火焰熔封管口,放冰箱或室內乾燥處保存.每半年檢查一次活力和雜菌情況。
(13)需要使用菌種,復活培養時,取沙土少許移入液體培養基內,置溫箱中培養。
此法多用於能產生孢子的微生物如黴菌、放線菌,因此在抗生素工業生產中應用最廣,效果亦好,但應用於營養細胞效果不佳。
斜面低溫保藏法
將菌種接種在適宜的固體斜面培養基上,待菌充分生長後,棉塞部分用油紙包紮好,移至2-8℃的冰箱中保藏.
保藏時間依微生物的種類而有不同,黴菌、放線菌及有芽孢的細菌保存2-4個月,移種一次.酵母菌兩個月,移種一次.細菌最好每月移種一次.
此法為實驗室和工廠菌種室常用的保藏法,優點是操作簡單,使用方便,不需特殊設備,能隨時檢查所保藏的菌株是否死亡、變異與汙染雜菌等.缺點是容易變異,因為培養基的物理、化學特性不是嚴格恆定的,屢次傳代會使微生物的代謝改變,而影響微生物的性狀;汙染雜菌的機會亦較多。
液氮冷凍保藏法
(1)準備安瓿管用於液氮保藏的安瓿管,要求能耐受溫度突然變化而不致破裂,因此,需要採用硼矽酸鹽玻璃製造的安瓿管,安瓿管的大小通常使用75×10mm的,或能容1.2mm液體的。
(2)加保護劑與滅菌保存細菌、酵母菌或黴菌孢子等容易分散的細胞時,則將空安瓿管塞上棉塞,1.05kg/cm2,121.3℃滅菌15分鐘:若作保存黴菌菌絲體用則需在安瓿管內預先加入保護劑如10％的甘油蒸餾水溶液或10％二甲亞碸蒸餾水溶液,加入量以能浸沒以後加入的菌落圓塊為限,而後再用1.05kg/cm2>,121.3℃滅菌15分鐘。
(3)接入菌種將菌種用10％的甘油蒸餾水溶液製成菌懸液,裝入已滅菌的安瓿管;黴菌菌絲體則可用滅菌打孔器,從平板內切取菌落圓塊,放入含有保護劑的安瓿管內,然後用火焰熔封.浸入水中檢查有無漏洞.
(4)凍結再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結至-30℃.若細胞急劇冷凍,則在細胞內會形成冰的結晶,因而降低存活率。
(5)保藏經凍結至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器的小圓筒內,然後再將小圓筒放入液氮保藏器內.液氮保藏器內的氣相為-150℃,液態氮內為-196℃。
(6)恢復培養保藏的菌種需要用時,將安瓿管取出,立即放入38-40℃的水浴中進行急劇解凍,直到全部融化為止.再打開安瓿管,將內容物移入適宜的培養基上培養。
此法除適宜於一般微生物的保藏外,對一些用冷凍乾燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細菌、難以形成孢子的黴菌、噬菌體及動物細胞均可長期保藏,而且性狀不變異.缺點是需要特殊設備。
液體石蠟保藏法
(1)將液體石蠟分裝於三角燒瓶內,塞上棉塞,並用牛皮紙包紮,1.05kg/cm2,121.3℃滅菌30分鐘,然後放在40℃溫箱中,使水汽蒸發掉,備用。
(2)將需要保藏的菌種,在最適宜的斜面培養基中培養,使得到健壯的菌體或孢子。
(3)用滅菌吸管吸取滅菌的液體石蠟,注入已長好菌的斜面上,其用量以高出斜面頂端1cm為準,使菌種與空氣隔絕。
(4)將試管直立,置低溫或室溫下保存(有的微生物在室溫下比冰箱中保存的時間還要長).
此法實用而效果好.黴菌、放線菌、芽孢細菌可保藏2年以上不死,酵母菌可保藏1-2年,一般無芽孢細菌也可保藏1年左右,甚至用一般方法很難保藏的腦膜炎球菌,在37℃溫箱內,亦可保藏3個月之久.此法的優點是製作簡單,不需特殊設備,且不需經常移種.缺點是保存時必須直立放置,所佔位置較大,同時也不便攜帶.從液體石蠟下面取培養物移種後,接種環在火焰上燒灼時,培養物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺,應特別注意。