土壤中放線菌的分離與純化

實驗目的

1掌握放線菌的生長特性，微生物的培養方法。

2掌握微生物實驗的基本生物技術，主要包括無菌操作技術，純種分離技術，純種培養技術，以及抗生素檢測等。

3掌握合成培養基，選擇培養基的製備方法。

4學習對微生物實驗的中出現問題的分析，解決方法

實驗材料

藥品：可溶性澱粉、KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、瓊脂、重鉻酸鉀

其他：高壓蒸汽滅菌鍋、扭力天平、藥匙、燒杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、試管、牛皮紙、硫酸紙、線繩、無菌培養皿、鐵鍬、小鏟、酒精棉球、鑷子、玻璃鉛筆。

實驗原理

放線菌是重要的抗生素產生菌，主要分布在土壤中（主要是鏈黴菌），其數量僅次於細菌。一般在中性偏鹼性、有機質豐富、通氣性好的土壤中含量較多。由於土壤中的微生物是各種不同種類微生物的混合體，為了研究某種微生物，就必須把它們從這些混雜的微生物群體中分離出來，從而獲得某一菌株的純培養。分離放線菌常用稀釋倒平板法。根據放線菌的營養、酸鹼度等條件要求，常選用合成培養基或有機氮培養基。如果培養基成分改變，或土壤預先處理（120℃熱處理1h），或加入某種抑制劑（如加數滴10%酚等），都可以使細菌，黴菌出現的數量大大減少，從而淘汰了其它雜菌。再通過稀釋法，使放線菌在固體培養基上形成單獨菌落，並可得到純菌株。

放線菌可以產生抗生素，抑制其他菌種的生長，故可用金黃色葡萄球菌（G+）和大腸桿菌（G-）作指示菌鑑別放線菌。

高氏一號合成培養基是培養放線菌的培養基。這種培養基是採用化學成分完全了解的純試劑配製而成的培養基，高氏一號培養基：碳源為可溶性澱粉、氮源為KNO3 、NaCl 、K2HPO4•3H2O 、MgSO4•7H2O 作為無機鹽，FeSO4•7H2O作為微生物的微量元素，提供鐵離子等組成

1.高氏一號合成培養基的製備

K2HPO4 •3H2O 0.125g，可溶性澱粉5g，硝酸鉀0.25, MgSO4•7H2O0.125g， FeSO4•7H2O 0.025g，氯化鈉0.125g，瓊脂5g，水250ml。

配製時，先依次加入上述藥品（除瓊脂外）順序溶解，加入無菌水至250ml，調節pH＝7.4，再加入瓊脂不斷攪拌震蕩至溶化後， 121℃滅菌20分鐘。

將6套平皿、12隻試管滅菌。

2. 土壤中放線菌的分離

1．編號，分裝：取6套無菌平皿，在皿底貼上標籤，註明土壤稀釋液的稀釋度（10-3、10-4、10-5）。每個稀釋度做兩個培養皿。然後在每皿中倒入已溶化並冷凝至50℃左右的高氏一號培養基15~20ml左右，待冷凝成平板。　

另取5支盛有9ml一隻盛有10ml無菌水的試管，排列於試管架上，依次標明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。

　2．稀釋傾注分離

　稱1g土樣放入10ml無菌水試管中振蕩10min，即10-1的土壤懸液，靜置30s。

用無菌吸管無菌操作取10-1濃度的土壤懸液1ml並加入編號10-2的無菌試管中，並吹吸吸管2~3次，吸時伸入管底，吹時離開水面，使其混合均勻。即為10-2濃度的土壤稀釋液。依此類推，直到稀釋至10-5的試管中（每個稀釋度換1支無菌吸管）。

如圖

　　

　3．倒平板分離培養

於上述盛有不同稀釋度菌液的培養皿中，倒入溶化後冷卻至45℃左右的高氏培養基約10—15ml，置水平位置，迅速旋動混勻，待凝固。（若融化的培養基溫度太高，會產生太多的冷凝水，影響觀察。）

　　用1ml無菌吸管分別精確地吸取10-4、10-5、10-6的稀釋菌液1ml，對號放入編好號的無菌培養皿中，每一濃度對應兩個平板。用無菌塗布棒（從濃度小液開始）將加入平板培養基上的土壤稀釋液在整個平板表面塗勻，塗完一個平板用酒精燈滅菌。

稀釋塗布平板法

　4培養 接種完畢，將平皿和試管放入28℃恆溫箱培養7天，觀察平皿上放線菌（主要是鏈黴菌）菌落。

菌種純化

1、倒平板 將加熱融化的高氏一號合成培養基倒平板，並標號。

2、平板劃線

劃線的方法很多，但無論哪種方法劃線，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進行稀釋，使形成單個菌落。常用的劃線方法有下列二種：

圖Ⅴ-3 劃線分離示意圖

⑴分區劃線 用接將培養皿底部用姆指和無名指固定成傾斜狀態，在火焰旁將培養皿稍微打開。在此同時，用環狀接種針在火焰旁刮取少許菌苔，在平板培養基的一邊，作第1次平行劃線 6～7條，轉動培養皿約70°角，用燒過冷卻的接種針，通過第1次劃線部分作第2次平行劃線(圖Ⅴ-3)，然後再用同樣方法，作第3次平行劃線。劃線時，接種針應與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養皿邊緣，也不要將培養基劃破。劃線完畢後，蓋上皿蓋，倒置於溫室培養。

⑵連續劃線 將挑取有樣品的接種環在平板培養基上作連續劃線(圖Ⅴ-4，B)。劃線完畢後，蓋上皿蓋，倒置28℃培養。

V—4劃線分離示意圖

拮抗實驗

長出菌落後，要判斷是否已分離到了純菌種。

1配置鑑別培養基 配置金黃色葡萄球菌和大腸桿菌培養基。

2標號 在兩平板上標註均勻間隔的7個區域。

2挑菌落 在純培養的平板上切取生長較好的放線菌落依次放入標註區域中（在火焰旁切取），置於28℃恆溫箱培養1天後可觀察到有抑菌圈生成。

討論

1 高氏培養基的配置關鍵是pH值的調節和重鉻酸鉀的加入。放線菌的最適生長條件是23~37，pH7.0～7.5，而在同樣條件下也利於黴菌生長。在高溫殺菌下，放線菌和黴菌的孢子仍可以存活，所以必須加入重鉻酸鉀抑制黴菌和細菌的生長（對放線菌無抑制作用）。否則黴菌大量生長。如圖

培養基配置時各成分的溶解順序應是先加緩衝化合物，後是主要元素、次要元素。調節pH值時，加入酸鹼要緩慢、少量、多加攪拌，防止局部過酸或過鹼而破壞營養成分。

我們第一次配置的高氏培養基很可能就是由於酸鹼調節時酸鹼過量和未加入重鉻酸鉀而導致失敗。

2 放線菌可以產生色素，且放線菌代表屬也分好幾種。其菌落一般為圓形，菌落質地緻密表面呈較緊密的絨狀或堅實、乾燥、多皺，地衣狀。表面乾燥。可作為鑑別菌種的基本參考依據。

孢子絲生長到一定階段可形成孢子由於孢子含有不同色素，成熟的孢子堆也表現出特定的顏色，而且在一定條件下比較穩定，故也是鑑定菌種的依據之一。但孢子的形態和大小不能籠統地作為分類鑑定的重要依據。

3 整個過程要保證在無菌條件下進行，培養基及儀器可用高壓蒸汽滅菌。接種時，實驗桌要用95％的酒精擦拭，且在接種時要在火焰區的無菌範圍內（空氣中含有大量灰塵、細菌和黴菌孢子等造成汙染），且打開培養基時間儘量短。

4 稀釋倒平板法時塗布要均勻，否則，細菌密度不均導致菌落生長過於集中，細菌無法充分利用營養成分影響生長，且在鑑別時較難看到明顯的抑菌圈。

稀釋時除了應用平板塗布外還用了劃線法。塗布主要是通過稀釋溶液方法減少細菌分布密度，劃線法通過多次劃線逐漸被稀釋，最後可得到單獨存在的菌落。

5 放線菌是產生抗生素最多的菌種，其可以抑制金黃色葡萄球菌，金黃色葡萄球菌是臨床上常見的致病菌，且耐藥性普遍，可觀察其對金黃色葡萄球菌的抑制產生的抑菌圈辨別菌種。放線菌的接種方法同細菌，多用密狀蜿蜒劃線法，以獲得大量菌體細胞，觀察孢子顏色。