超大孔填料在蛋白質分離純化中的應用

 

　　層析純化技術由於其高選擇性、靈活性、易放大性等優點，已經成為蛋白質藥物純化中不可或缺的技術。傳統的層析填料為多糖基質，孔徑一般在100 nm以下。1970年代出現了大孔和微孔無機材料矽填料，雖然增大了孔道、提高了層析的解析度和流速，但只能在PH2-7.5範圍內穩定，不利於分離純化在鹼性範圍內穩定的蛋白質或是需要鹼性層析條件的分離，從而限制了其在大規模快速分離蛋白質層析上的應用。多孔聚合物微球由於其高的比表面積、高的機械強度和多樣的表面特徵，常被用作層析分離純化的填料。目前已發展出了多種表面基團、基質種類的層析填料，成功用於疫苗、病毒、抗體、酶、細胞因子等的分離純化。

　　層析純化病毒、病毒樣顆粒等生物大分子的瓶頸問題

　　隨著病毒、病毒樣顆粒在疫苗、腫瘤治療、免疫治療中的地位越來越重要，這類複雜生物大分子的分離純化需求也逐漸增加。然而傳統填料由於孔徑較小，蛋白質只能以擴散方式通過填料，傳質速率慢，處理量低，造成分離時間長、容易失活等問題[1]。當蛋白質體積較大時，填料表面在吸附一層蛋白後，由於體積位阻以及靜電排斥作用，會阻礙其它的蛋白質進一步進入孔內，造成填料的載量下降。另一個限制是病毒或疫苗，尤其是帶有包膜的病毒或疫苗，在狹窄的填料孔徑內發生吸附時非常容易發生結構變化，破壞其整體結構。在B肝病毒表面抗原(HBsAg)的純化中發現這種病毒樣顆粒在層析時會發生解聚[2]，經過離子交換層析分離後，疫苗的回收率通常不到50%[3, 4]。而抗原的結構發生變化以後，就會對其免疫原性產生影響，所以需要在純化過程中儘可能維持抗原的結構。

　　為了解決針對病毒及病毒樣顆粒純化的瓶頸問題，目前已有採用膜色譜、超大孔貫穿孔顆粒填料及整體柱的策略進行純化的案例，成功純化了包括人乳頭瘤病毒、番茄花葉病毒、流感病毒、腺病毒、慢病毒及各種病毒樣顆粒。

　　病毒及病毒樣顆粒的分離純化

　　根據文獻報導，超大孔填料相比傳統層析填料不僅在載量及處理速度上有極大的優勢，還更有利於病毒及病毒樣顆粒的結構保持。

　　例如，在重組B肝病毒表面抗原的分離純化中，採用具有120nm及280nm超大孔徑的離子交換填料DEAE-AP-120 nm和DEAE-AP-280 nm(商品名為中科森輝的Giga系列)具有比傳統填料DEAE-FF高7倍以上的動態載量[1]。此外，採用ELISA測定抗原收率，發現採用超大孔填料能夠減少重組B肝病毒表面抗原在層析過程中的裂解，從而顯著提高活性抗原的收率。

　　

重組B肝病毒表面抗原在不同孔徑離子交換填料上

　　的吸附動力學[1]

　

　重組B肝病毒表面抗原從不同孔徑的填料上洗脫下來的

　　ELISA回收率[1]

　　對病毒的分離純化同樣有類似的效果。例如在滅活口蹄疫病毒的純化中，DEAE-FF導致嚴重的病毒裂解。而採用具有100nm以上孔徑的超大孔填料，不僅載量提高10倍以上，還能顯著提高病毒在填料上吸附時的熱穩定性，從而減少病毒的裂解，具有更高的收率。最終的分離純化單步收率達90%以上[5]。

　　滅活口蹄疫病毒在傳統填料與超大孔填料上的吸附解離過程

　　與商品填料的小孔道填料相比，超大孔結構可能從以下幾方面提高對蛋白質構象的穩定性：

　　1)增大孔道(受限空間)：根據蛋白質摺疊行為計算顯示，蛋白質的摺疊速率與空腔大小、形狀密切相關，也即當填料孔道與蛋白的相對尺寸超過某一閾值後，蛋白的摺疊行為將不受空腔大小影響。與數十納米中孔結構的傳統填料的相比，數百納米超大孔結構會因孔道增大、與蛋白接觸面積減小，從而對某一尺寸下蛋白質的變構行為有所改善。

　　2)界面曲率：小孔徑填料孔道曲率大，填料與蛋白質接觸面積大，因此受更大吸附力影響，蛋白質二級結構變化越嚴重。而曲率更大的超大孔孔道對蛋白二級結構的保護比狹窄孔道更有優勢。

　　表面曲率變化對蛋白接觸面積的影響

　　3)改善配基與蛋白活性區域的接觸面積：超大孔微球內部數百納米孔道在修飾配基後可能會有效改善傳統填料狹窄孔道內由於配基擁擠造成的蛋白質失活現象。

　　4)減少蛋白在孔道內的靜電排斥作用：有研究者認為，在離子交換填料上蛋白質起初會在孔道入口處形成一圈靜電層，這一靜電層會對後來蛋白繼續進入孔道產生排斥作用從而使孔道關閉，動態載量下降。如果將超大孔填料修飾為離子交換樹脂，由於孔道尺寸顯著擴大可能會有效改善蛋白吸附靜電層對孔道的封閉作用，從而有效引導蛋白質進入超大孔道，提高回收率。

　　快速分離蛋白質及pDNA

　　除了應用於病毒及病毒樣顆粒的分離純化的分離純化，利用超大孔填料傳質速度快的優勢，將超大孔填料鍍上親水錶層，再接上不同配基製成多種形式的層析填料，用於快速高解析度的純化蛋白混合物或質粒。超大孔填料製備成的親和層析、反相層析和離子交換層析填料廣泛的應用在蛋白質的分離純化方向，顯示出超大孔填料比傳統分離填料高速高解析度的蛋白質純化優勢。

　　例如以肌紅蛋白、轉鐵蛋白和牛血清白蛋白的混合溶液為模擬體系，考察不同流速下超大孔聚苯乙烯陰離子交換介質(DEAE-AP，商品名為Giga系列)的分離效果，並與DEAE 4FF介質進行了對比。實驗結果(圖2)顯示，作為對照的DEAE-4FF介質在流速達到361 cm/h時，分離效果已明顯降低，而超大孔介質可以在流速高達1084 cm/h的條件下操作，分離效果良好，能夠在6 min內實現三種生物大分子的快速分離。

　　超大孔填料應用前景與展望

　　近年來，隨著生命科學的發展，生物樣品越來越複雜，如人的血樣、尿樣、組織樣品等，對生物分離分析技術提出更高的要求。根據超大孔填料固有的諸多優點，通過合成不同種類的超大孔固定相及在固定相上做不同功能的衍生，超大孔填料已經被廣泛應用於生物分離分析中，但也存在一些問題。因此，發展新的製備手段，優化製備條件和過程，探索製備和分離機理，對於開闢新的應用領域以及開展實際樣品的分離分析有更大的理論和現實意義。

　　根據已有的文獻報導，我們可以預測今後幾年的相關工作仍會集中在以下幾個方面：

　　(1)規則的聚合物整體材料內部形態。如獲得規則的3D網絡骨架，可控的孔徑尺寸和分布。

　　(2)繼續在微分離系統中擴展其應用。如在加壓電色譜、微流控晶片材料、微流色譜和納流色譜系統，甚至納米器件開發等諸多方面大顯身手。

　　(3)表面物理化學性質的調控向功能化、智能化方向發展。如基於分子印跡技術、溫度響應以及pH響應的表面智能化的整體材料。

　　(4)製備規模整體柱的開發及其在生物下遊技術中的應用。

　　目前，已經有一部分整體柱實現了商品化，但種類有限，還無法與種類繁多的顆粒型填充柱相提並論，也遠未能滿足分離分析的需求。而顆粒型的超大孔填料，由於其製備較困難、批次間重複性較差、價格昂貴等，也沒有得到廣泛的應用。相對於超大孔填充柱，有機相整體柱存在因流動相變會發生溶脹或收縮、機械強度差、比表面積小、柱容量差以及聚合過程中產生的微孔不利於小分子樣品的分析等問題，現有報導大都用於生物大分子的分離。矽骨架整體柱也存在必須預先聚合好裝入套管中，製備繁瑣，比表面積較小的問題。因此，如何以更簡便、有效的方式製備高效新型的超大孔填料並將其應用於實際樣品的分離分析仍然是今後工作的重心。在實際工作中所面臨的層出不窮的問題也是推動新型超大孔填料製備技術和方法發展的源源不竭的動力，在諸多的嘗試中很可能就會出現某些性質優良的超大孔填料，這也預示著將來商品化的超大孔會越來越多。

　　部分商品化的超大孔層析介質

　　超大孔填料因其具有獨特的多孔結構，與傳統填料相比具有更加優良的滲透性和傳質速率，可以在較低的操作壓力下實現高效和快速的分離，已成為繼多聚糖、交聯與塗漬、單分散之後的第四代分離填料。可以預測，隨著製備技術的不斷提升，超大孔填料在生命科學、醫藥、環境和化學化工等領域必將大有可為。

　　參考文獻

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　　[2] P.M. Kramberger P, Boben J, Ravnikar M, ?trancar, A.S.m.c.a.b. in, p.a.f.q.o.t.m. virus., J. Chromatogr. A 1144(1).

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　　[4] W. Zhou, J. Bi, J.C. Janson, Y. Li, Y. Huang, Y. Zhang, Z. Su, Molecular characterization of recombinant Hepatitis B surface antigen from Chinese hamster ovary and Hansenulapolymorpha cells by high-performance size exclusion chromatography and multi-angle laser light scattering, Journal of Chromatography B, 838 (2006) 71-77.

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