視頻教學：
重點知識：
1.識記微生物的培養、分離與計數
2.微生物的培養和純化
(1)為了確定培養基的滅菌是否合格，微生物學實驗一般會設置空白對照：隨機取若干滅菌後的空白平板培養基在適宜條件下培養一段時間，觀察培養基上是否有菌落生成。
(2)觀察菌落需用固體培養基，因此培養基要添加瓊脂。
(3)倒平板的溫度一般在50 ℃左右較為適宜，溫度過高會燙手，溫度過低培養基又會凝固。
(4)平板需倒置，這樣既可減少培養基表面的水分揮發，又可防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成培養基汙染。
(5)平板劃線法只適用於微生物的提純，不適合進行計數，並且在最後一次劃線的末端處的菌種最純。
(6)利用稀釋塗布平板法的計算公式估算水樣中的活菌數：(C÷V)×M，其中C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數，V代表塗布平板時所用的稀釋液的體積(mL)，M代表稀釋倍數。
(7)菌種可採用甘油管藏法長期保存。
精品課件：
教案：
一、選擇培養基
1．水生棲熱菌的篩選：水生棲熱菌能在70～80 ℃的高溫條件下生存，而絕大多數微生物在此條件下不能生存。
2．選擇培養基：在微生物學中，允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基。
二、微生物的選擇培養
1．分解尿素的細菌的分離
分解尿素的細菌能合成脲酶，該酶能催化尿素分解產生NH3，以此作為細菌生長的氮源。要將土壤稀釋液中能分解尿素的細菌分離出來，培養基的配方設計思路是培養基中除含有細菌必需的碳源、水、無機鹽外，只含有尿素一種氮源。
2．稀釋塗布平板法分離分解尿素的細菌
土壤中細菌的數量龐大，要想得到能分解尿素的細菌的純培養物，必須要對土樣進行充分稀釋，然後再將菌液塗布到製備好的選擇培養基上，操作過程如下：
採集土樣→將10 g土樣加入盛有90 mL無菌水的錐形瓶中，充分搖勻。取1 mL上清液加入盛有9 mL無菌水的試管中，依次等比稀釋→取0.1 mL菌液，滴加到培養基表面→將塗布器浸在盛有酒精的燒杯中→將塗布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、塗布器冷卻後，再進行塗布→用塗布器將菌液均勻地塗布在培養基表面。塗布時可轉動培養皿，使塗布均勻→塗布的菌液被培養基吸收後，將平板倒置，放入30～37 ℃的恆溫箱中培養1～2 d。
三、微生物的數量測定
1．稀釋塗布平板法
(1)原理：當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個單菌落，來源於樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。為了保證結果準確，一般選擇菌落數為30～300的平板進行計數。
(2)注意問題：統計的菌落數往往比活菌的實際數目少。這是因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。
2．顯微鏡直接計數法
(1)方法：利用特定的細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下觀察、計數。
(2)注意問題：統計的結果一般是活菌數和死菌數的總和。
判斷對錯(正確的打「√」，錯誤的打「×」)
1．選擇分解尿素的細菌的培養基為液體培養基。(×)
提示：選擇分解尿素的細菌的培養基為固體培養基，固體培養基具有分離、鑑定作用。
2．用平板劃線法培養計數，應選擇菌落數在10～100的平板。 (×)
提示：微生物計數採用稀釋塗布平板法，為保證結果準確，應選擇菌落數在30～300的平板。
3．統計菌落數目時，統計的菌落數就是活菌的實際數目。(×)
提示：由於當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，所以統計的菌落數往往比活菌的實際數目少。
4．統計菌落數目的理論依據是一個菌落來源於樣品稀釋液中的一個活菌。(√)
5．分解尿素的細菌在分解尿素時，可以將尿素轉化為氨，使得培養基的pH降低。(×)
提示：尿素分解菌將尿素轉化為氨，使培養基的pH升高。
6．在用塗布器塗布平板時，為了操作方便可完全打開培養皿蓋。(×)
提示：為了防止雜菌汙染，不能完全打開皿蓋。
選擇培養基
1．目的：從眾多的微生物中分離所需要的微生物。
2．三種篩選方法的特點及舉例
方法
特點
舉例
利用微生物的營養特點進行選擇培養
通過控制培養基的營養成分，使某種微生物能生長，其他微生物不能生長
利用只含有尿素一種氮源的培養基，可篩選出分解尿素的細菌
利用某種化學物質進行的選擇培養
在完全培養基中加入某些化學物質，利用加入的化學物質對微生物產生的影響，抑制某些微生物，同時選擇所需的微生物
加入青黴素可以分離出酵母菌和黴菌
利用培養條件進行的選擇培養
改變微生物的培養條件
將培養基放在高溫環境中培養可以得到耐高溫的微生物
合作探究：(1)如何從大豆田土壤中分離出固氮微生物？
提示：從大豆田土壤取土樣，利用缺乏氮源的培養基可分離出固氮微生物。
(2)要分離出分解纖維素的微生物，應在什麼樣的環境中取土樣？應配製什麼樣的培養基？
提示：應從富含纖維素的培養基中取土樣，如樹林中多年落葉形成的腐殖土。應配製以纖維素為唯一碳源的培養基。
(3)根據選擇培養基的原理，如何篩選出耐酸菌？
提示：可將培養基的pH調至酸性，再接種培養。
1．原油中含有大量有害的、致癌的多環芳烴。土壤中有些細菌可以利用原油中的多環芳烴為碳源，在培養基中形成分解圈。為篩選出能高效降解原油的菌株並投入除汙，某小組同學設計了相關實驗。下列有關實驗的敘述，不正確的是()
A．應配製來源於被原油汙染土壤的土壤稀釋液備用
B．配製以多環芳烴為唯一碳源的選擇培養基
C．將土壤稀釋液滅菌後接種到選擇培養基上
D．在選擇培養基上能形成分解圈的即為所需菌種
C[為了篩選、獲取能利用多環芳烴為碳源的菌種，首先是取材，應配製來源於被原油汙染土壤的土壤稀釋液備用，A項正確；其次配製以多環芳烴為唯一碳源的選擇培養基，B項正確；然後進行接種，在無菌環境下，將土壤稀釋液接種到選擇培養基上，在適宜的條件下進行培養，若將土壤稀釋液進行滅菌，就不能篩選出能高效降解原油的菌株，C項錯誤；在選擇培養基上形成的菌落，若該菌落周圍有分解圈，即為所需菌種，D項正確。]
2．從自然菌樣中篩選較理想生產菌種的一般步驟：採集菌樣→富集培養→純種分離→性能測定。請回答下列問題：
(1)不同微生物的生存環境不同，獲得理想微生物的第一步是從適合的環境採集菌樣，然後再按一定的方法分離、純化。培養嗜鹽菌的菌樣應從________(填「高鹽」或「低鹽」)環境採集，培養厭氧菌的菌樣應從________(填「有氧」或「無氧」)環境採集。
(2)富集培養指創設僅適應於該條件的微生物旺盛生長的特定的環境條件，使待分離微生物在群落中的數量大大增加，從而達到從自然界中分離到所需的特定微生物目的的微生物培養方法。對嗜鹽菌富集培養的培養基應是________培養基；對含耐高溫澱粉酶的微生物富集培養應選擇________的培養基，並在________條件下培養。
(3)實驗室最常用的滅菌方法是高溫處理。高溫滅菌的原理是高溫使微生物的蛋白質和核酸等物質發生__________。________滅菌法是微生物研究和教學中應用最廣、效果最好的溼熱滅菌法。
(4)下圖是採用純化微生物培養的兩種接種方法接種後培養的效果圖解，請分析接種的具體方法。
獲得圖A效果的接種方法是______________________________________；獲得圖B效果的接種方法是____________________________________。
[解析](1)在長期自然選擇的作用下，生物與其生活環境相適應，培養嗜鹽菌的菌樣應從高鹽環境中採集，培養厭氧菌的菌樣應從無氧環境中採集。(2)對嗜鹽菌富集培養的培養基應是加鹽培養基，對含耐高溫澱粉酶的微生物富集培養應選擇以澱粉為唯一碳源的培養基且在高溫條件下培養。(3)高溫能使蛋白質和核酸發生不可逆轉的變性，高壓蒸汽滅菌法是應用最廣、效果最好的溼熱滅菌法。(4)從培養基中菌落分布看，獲得圖A用的是稀釋塗布平板法，獲得圖B用的是平板劃線法。
[答案](1)高鹽 無氧 (2)加鹽 以澱粉為唯一碳源 高溫 (3)變性 高壓蒸汽 (4)稀釋塗布平板法 平板劃線法
微生物計數的方法
微生物生長量的測定有計數法、重量法、生理指標法等方法，但是一般使用計數法，計數法可分為直接計數法和間接計數法。二者的比較如下表所示：
項目
直接計數法
間接計數法
原理
利用特定細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下計算一定容積的樣品中微生物的數量
當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源於樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌
主要用具
顯微鏡、細菌計數板
培養基
計數數據
菌體本身
培養基上菌落數
優點
計數方便、操作簡單
計數的是活菌
缺點
死菌、活菌都計算在內
操作較複雜，有一定誤差
計算公式
每毫升原液含菌數＝每小格平均菌體數×400×10 000×稀釋倍數
每毫升原液含菌數＝培養基上平均菌落數×稀釋倍數÷塗布液體積
合作探究：1.在用稀釋塗布平板法對微生物進行計數時，統計菌落數目的理論依據是什麼？
提示：當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源於樣品稀釋液中的一個活菌。
2．在稀釋塗布平板法中，為何需要塗布3個平板？
提示：作為重複實驗，統計時取平均值，以減少偶然因素對實驗結果的影響，增強實驗結果的說服力。
3．為什麼一般選擇菌落數為30～300的平板進行計數？
提示：若平板上菌落數過多，說明稀釋度過低，菌體的密度大，就會出現更多的兩個或兩個以上的菌體形成的菌落，結果不準確，且計數較困難。若平板上菌落數過少，菌落形成的偶然性大，結果也不準確。
4．為什麼要選取菌落數目穩定時的記錄作為結果？
提示：儘量縮小統計的菌落數與實際活菌數的差值，因為繁殖慢的菌體開始看不出明顯的菌落。
5．稀釋塗布平板法和顯微計數法對微生物計數產生的實驗誤差如何？試分析原因。
提示：稀釋塗布平板法計數的值比實際值小，原因是當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落；顯微計數法計數的結果比實際值大，原因是顯微鏡下無法區分細胞的死活，計數時包括了死細胞。
1．用稀釋塗布平板法測定某一土壤樣品中的細菌數，在對應稀釋倍數為106的培養基中，得到以下幾種統計結果，正確的是()
A．塗布了1個平板，統計的菌落數是230
B．塗布了2個平板，統計的菌落數是215和260，取平均值238
C．塗布了3個平板，統計的菌落數分別是21、212和256，取平均值163
D．塗布了3個平板，統計的菌落數分別是212、240和250，取平均值234
D[在設計實驗時，一定要塗布至少3個平板作為重複組，才能增強實驗的說服力與準確性，A、B錯誤。C項雖然塗布了3個平板，但是，其中1個平板的計數結果與其他的相差太遠，說明在操作過程中可能出現了錯誤，此時，不能簡單地用3個平板的計數值來求平均值，C錯誤。]
2．下圖為「土壤中分解尿素的細菌的分離與計數」實驗中樣品稀釋示意圖。據圖分析，下列敘述正確的是()
A．3號試管的稀釋倍數為103倍
B．4號試管中稀釋液進行平板培養得到的菌落平均數恰好為5號試管的10倍
C．5號試管的結果表明每克土壤中的菌株數為1.7×109個
D．該實驗方法統計得到的結果往往會比實際活菌數目要多
C[3號試管的稀釋倍數為104倍，A項錯誤；4號試管中稀釋液進行平板培養得到的菌落平均數不一定恰好為5號試管的10倍，B項錯誤；5號試管的結果表明每克土壤中的菌株數為(168＋175＋167) ÷3÷0.1×106＝1.7×109（個），C項正確；在固體培養基上可能存在兩個或多個菌體形成一個菌落的情況，得到的結果往往會比實際活菌數目少，D項錯誤。]
用稀釋塗布平板法計數微生物的方法
(1)稀釋塗布平板操作要求：按照平行重複原則，每一稀釋度的菌液塗布3個或3個以上的平板。
(2)計數的時機：當各平板上菌落數目穩定時進行計數。
(3)選擇可用於計數的平板：選擇菌落數在30～300的平板(相同稀釋度的平板均符合該特點)進行計數，然後取平均值。
(4)每克樣品中的菌株數＝某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數÷塗布平板時所用的稀釋液的體積×稀釋倍數。
[課堂小結]
知 識 網 絡 構 建
核 心 語 句 背 誦
1.選擇培養基是指允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養基。
2.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素為唯一氮源的選擇培養基分離能分解尿素的細菌。
3.為確保結果準確，一般選擇菌落數在30～300的平板進行計數。
4.當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源於樣品稀釋液中的一個活菌。
5.統計的菌落數往往比活菌的實際數目少，這是因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。
1．分離土壤中分解尿素的細菌，對培養基的要求是()
①加尿素 ②不加尿素 ③加瓊脂 ④不加瓊脂 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸鹽 ⑧不加硝酸鹽
A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧
C．①③⑤⑧ D．①④⑥⑦
C[尿素和硝酸鹽都能作為氮源，而培養尿素分解菌的培養基應是以尿素為唯一氮源的固體培養基。因此培養基中應不加硝酸鹽，加入尿素和瓊脂。葡萄糖作為碳源，也需要加入。]
2．高中生物學實驗中，在接種時不進行嚴格無菌操作對實驗結果影響最大的一項是()
A．將少許乾酵母加入新鮮的葡萄汁中
B．將毛黴菌液接種在切成小塊的鮮豆腐上
C．將轉基因植物葉片接種到無菌培養基上
D．將土壤浸出液塗布在無菌的選擇培養基上
C[不進行嚴格的滅菌對葡萄酒製作的影響不大，因為多數微生物不能在缺氧、酸性和含糖較高的環境中生存，A不符合題意；不進行嚴格的滅菌對腐乳製作的影響不大，因為腐乳製作時還需在其中放入酒精、鹽和香辛料等，這些物質都具有殺菌作用，B不符合題意；植物組織培養要求嚴格的無菌環境，如果不進行嚴格無菌操作，會造成培養的幼苗生長緩慢甚至培育失敗，C符合題意；選擇培養基是根據要培養的微生物的代謝特點製備的，一般的雜菌在其上面也很難生存，D不符合題意。]
3．尿素是一種重要的氮肥，農作物不能將其直接吸收利用，而是通過土壤中的細菌將其分解為氨和CO2後才能被農作物利用。請回答下列問題：
(1)土壤中的某些細菌能分解尿素是因為該種細菌能合成________。
(2)為篩選尿素分解菌而製備的培養基中含有的營養物質除尿素外，還包括水、碳源、________等，該培養基能篩選出目的菌株的原因是_______________。
(3)一般依據尿素分解菌菌落的________、隆起程度和顏色等特徵來統計菌落數目。現將10 mL尿素分解菌懸液進行梯度稀釋，分別取0.1 mL稀釋倍數為106的樣液接種到3個培養基上，培養一段時間後，統計菌落數分別為39、42、45，則1 mL懸液中活細菌數量為________個。上述過程採用的接種方法是______________。
(4)為檢驗培養基及培養皿滅菌是否合格，可採取的措施是______________。
[解析](1)分解尿素的細菌能合成脲酶，將尿素分解。(2)微生物的培養基中需含有水、無機鹽、碳源和氮源，尿素作為氮源。因為只有能合成脲酶的細菌才能利用尿素作為氮源生長，因此該培養基能篩選出分解尿素的細菌。(3)一個菌落為一個細菌繁殖的後代，不同的微生物的菌落特徵不同，菌落的特徵包括形狀、大小、隆起程度，據此來統計菌落的數目。微生物計數的方法採用稀釋塗布平板法接種，1 mL懸液中活細菌的數目為(39＋42＋45)÷3÷0.1×106＝4.2×108(個)。(4)可單獨設置一個滅菌後不接種樣液的含培養基的培養皿進行培養，觀察該培養基上是否出現菌落，從而判斷滅菌是否合格。
[答案](1)脲酶 (2)無機鹽 只有以尿素為唯一氮源的細菌才能在該培養基上生長 (3)形狀、大小 4.2×108 稀釋塗布平板法 (4)單獨設置一個滅菌後不接種樣液的培養皿(含培養基)進行培養
練習：
1.回答下列與細菌培養相關的問題。
(1)在細菌培養時，培養基中能同時提供碳源、氮源的成分是________(填「蛋白腖」 「葡萄糖」或「NaNO3」)。通常，製備培養基時要根據所培養細菌的不同來調節培養基的pH，其原因是___________________。硝化細菌在沒有碳源的培養基上______(填「能夠」或「不能」)生長，原因是_________________________。
(2)用平板培養細菌時一般需要將平板______(填「倒置」或「正置」)。
(3)單個細菌在平板上會形成菌落，研究人員通常可根據菌落的形狀、大小、顏色等特徵來初步區分不同種的微生物，原因是________________________________。
(4)有些使用後的培養基在丟棄前需要經過_____處理，這種處理可以殺死丟棄物中所有的微生物。
2.已知一種有機物X(僅含有C、H兩種元素)不易降解，會造成環境汙染。某小組用三種培養基篩選土壤中能高效降解X的細菌(目標菌)。
Ⅰ號培養基：在牛肉膏蛋白腖培養基中加入X(5 g/L)。
Ⅱ號培養基：氯化鈉(5 g/L)，硝酸銨(3 g/L)，其他無機鹽(適量)，X(15 g/L)。
Ⅲ號培養基：氯化鈉(5 g/L)，硝酸銨(3 g/L)，其他無機鹽(適量)，X(45 g/L)。
回答下列問題：
(1)在Ⅰ號培養基中，為微生物提供氮源的是_______________。Ⅱ、Ⅲ號培養基中為微生物提供碳源的有機物是____。
(2)若將土壤懸浮液接種在Ⅱ號液體培養基中，培養一段時間後，不能降解X的細菌比例會_____，其原因是__________________。
(3)Ⅱ號培養基加入瓊脂後可以製成固體培養基，若要以該固體培養基培養目標菌並對菌落進行計數，接種時，應採用的方法是_______________。
(4)假設從Ⅲ號培養基中得到了能高效降解X的細菌，且該菌能將X代謝為丙酮酸，則在有氧條件下，丙酮酸可為該菌的生長提供_____和___________________。
甲同學塗布了3個平板，統計的菌落數分別是110、140和149，取平均值133.
乙同學塗布了3個平板，統計的菌落數分別是27、169和176，取平均值124.
有人認為這兩位同學的結果中，乙同學的結果可信度低，其原因是：____________。
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