實驗專欄丨親和層析法純化抗體技術指南來了!

2021-01-20 中洪博元醫學實驗幫


在無數應用中，抗體仍然是非常有用的，包括基礎研究、成像、靶向傳送、色譜、診斷和治療。在生產階段,抗體一般都存在於複雜的細胞中，而且它們的大部分應用都需要純化後使用。在多種不同的技術中，親和層析是純化抗體最具選擇性、快速和容易的純化方法。 

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親和層析是液相層析方法中選擇性和通用性最好的技術，依賴於蛋白及其配體的可逆性定點結合，如激素與其受體，酶與其底物，抗體與抗原等。可以利用這種特異性的相互作用，將相互作用物質中的一相，被稱為親和配基，固定到柱子上作為固定相來進行親和層析。通過親和配基的選擇性吸附，目的蛋白從複雜組分中洗脫出來。洗脫完畢後，層析柱再生，用於下一個樣品。


親和層析是最常用的生物物質分離方法之一，具有特異性高，速度快，操作簡便的特點。成熟的技術模型包括抗體或者抗體片段、His標籤蛋白、GST標籤蛋白、蛋白酶、凝血因子等的分離純化。

親和層析可以選擇多種不同類型的結合劑（配基）和固相支持物（基質），通過優化不同的屬性，如特異性，選擇性，可重複性，交聯化學，成本有效性等，親和層析可以用來大規模地純化抗體，獲得想要的產率和純度。多年以來，不斷努力發現和製造高質量的介質和配基，輔以優化有效的親和層析方法，來達到以經濟有效方法產生越來越多高純度的目標抗體。

表1  用於親和層析的不同基質

類型

示例

商業名稱

天然

瓊脂糖

瓊脂糖

葡聚糖

葡聚糖

纖維素珠

纖維素珠

化學合成

丙烯醯胺

生物凝膠

聚苯乙烯

聚苯乙烯

聚甲基丙烯酸甲酯

分離HEMA

無機

多孔二氧化矽

多孔二氧化矽

玻璃纖維

玻璃纖維

二氧化鈦

二氧化鈦 


⒈實驗儀器：蛋白A柱（含10ml或5ml填料）；泵；離心管；離心機；pH試紙；過濾器；玻璃柱。


⒉實驗試劑

TBS緩衝溶液：6.06gTris(50mM),8.78gNaCl(150mM)以及0.5g疊氮化鈉(0.05%)溶於1L蒸餾水中，並用HCl調節pH7.4。


中和緩衝溶液：121.2gTris(1M),87.8gNaCl(1.5M),0.37gEDTA(1mM)及5g疊氮化鈉(0.5%)溶於1L蒸餾水中，並用HCl調節pH8.0。


洗脫緩衝溶液(pH2.7)：將3.75g甘氨酸(50mM)溶解於1L蒸餾水中，用HCl調節pH2.7。

⒈準備蛋白AsepharoseCL-4B親和柱

通常準備5ml或10ml蛋白AsepharoseCL-4B填料，在真空瓶中將等體積的填料和TBS緩衝溶液混合，攪拌。抽真空約15分鐘以除去填料中的氣泡，否側在柱中形成的氣泡影響柱子的容量和分離效果。將蛋白AsepharoseCL-4B填料緩慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度為1ml/分-2ml/分，避免柱幹，利用10倍於床體積並經過預冷的TBS緩衝溶液平衡柱子。


⒉製備抗血清

 將抗血清放入冰水或4°C冰箱中緩慢解凍以避免蛋白質的聚集。在蛋白質解凍過程中出現的聚集可通過37°C預熱而溶解。加入固體疊氮化鈉至濃度為0.05%，4°C，15,000xg離心5分鐘，移出澄清的抗血清再經過濾器過濾除去多餘的脂。

⒊親和層析

將抗體用TBS緩衝溶液以1：5的比例進行稀釋，再用過濾器進行過濾。以每分鐘0.5ml的速度將抗血清上到柱上,為保證抗血清與填料的結合，需連續上柱2次並保留上樣流出液。用TBS緩衝溶液清洗柱子至Aλ280nm<0.008後加pH2.7洗脫緩衝溶液，以0.5ml/min的速度洗脫至所有蛋白均流下來。用已經加入100ul中和緩衝溶液的1.5mlEP管分管收集洗脫液，混勻後用pH試紙檢查洗脫液的pH，如果pH低於7可利用中和緩衝液調至約pH7.4以防止抗體的變性。
在柱中加入10ml,pH1.9洗脫緩衝溶液，按上述方法收集洗脫液至Aλ280nm<0.008。


利用分光光度計測定各管中蛋白質的含量。若蛋白濃度低於0.5mg/ml可加入10%的甘油以便保存，將純化的抗體分裝後在2°C~8°C保存。


用含0.05%疊氮化鈉的TBS緩衝溶液清洗柱子後將柱子儲存在2°C~8°C環境。


【實驗結果】

利用SDS/PAGE檢查洗脫獲得的蛋白純度並利用免疫電泳技術檢查純化後抗體的滴度。


【注意事項】

⒈疊氮化鈉有毒，應戴手套並小心操作

⒉ 在純化過程中，預冷的TBS緩衝溶液可減少蛋白質的非特異性結合和微生物的代謝。


參考文獻：

Arora S, Saxena V, Ayyar BV.Affinity chromatography: A versatile technique for antibody purification.Methods. 2017 Mar 1;116:84-94.  

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