來源：來源網絡 2007-03-30 18:50
一、實驗目的與原理
生物大分子化合物的重要特徵之一是具有與某些相對應的分子通過次級鍵或共價鍵專一結合的能力即親和力。例如酶與抑制劑之間，抗原與抗體之間，結合的雙方不僅是專一的，而且結合以後可以在不喪失生物活性的基礎上用物理或化學的方法進行解離。根據這一特性，如果把具有親和力的一對分子的某一方連接於水不溶的固體載體上作為固定相，那麼另一方隨著流動相流經該固定相的時候，雙方便親和結合為一個整體。然後只有改變某種物理條件或化學條件使結合的雙方解離，即能得到於固定相有特異親和力的某一特定物質。這種利用生物分子和相對應分子之間親和結合和解離性質而建立起來的層析方法稱之為親和層析。
本實驗通過將胰蛋白酶抑制劑－雞卵粘蛋白與Sephadex-G75偶聯及親和層析純化胰酶的操作，以了解親和層析的基本原理，掌握親和柱材活化偶聯及親和層析操作的基本過程和技術。
二、儀器與試劑
1.雞卵粘蛋白製備
2．Sephadex-G75的活化和偶聯
2．5g乾重的葡聚糖凝膠Sephadex-G75 、0.05M NaCL溶液 50ml、純化的雞卵粘蛋白87.5mg、 5% K2CO3、0.27gKBH4 （溶於20ml水）
3．親和層析
0.1M Tris-HCL pH7.5(含0.5M KCL,0.05M CaCL2) 200ml、粗胰蛋白酶約50ml 、0.1N甲酸鉀、0.5M KCL pH2.5 100ml
儀器器材：抽濾瓶500－1000ml、層析柱、紫外分光光度計、紫外蛋白檢測儀、燒杯漏鬥、移液管、磁力攪拌器
三、操作步驟
1、雞卵粘蛋白的製備
2、Sephadex-G75的活化及偶聯
2.5g乾重的葡聚糖凝膠Sephadex-G75溶脹洗滌數次，緩慢攪拌，加入0.05M NaCL溶液50ml ,30min，蒸餾水洗滌數次，抽乾備用，活化凝膠，純化的雞卵粘蛋白87.5mg 溶於35ml水，加入活化葡聚糖凝膠，75％K2CO3，調pH7.5-9.0,緩慢攪拌3h。反應過程隨時加入5％K2CO3,以維持pH的穩定。0.27gKBH4 溶於20ml水，緩慢攪拌加入上述體系反應5h，pH維持在6.5-7.5，洗滌。
3、胰蛋白酶的親和層析
卵類粘蛋白在pH7－8的條件下能與胰蛋白酶專一地結合，而在pH2－3時又能解離，因而掌握好上柱地PH條件和洗脫緩衝條件，便可將胰蛋白酶從含雜蛋白地粗酶液中選擇性地結合於柱上，待洗去不結合或非專一性結合地雜蛋白後，改變PH值便可將胰蛋白酶洗脫下來。從而達到純化地目的。由於親和層析結合地專一性，上柱體積可以比較大，得到濃縮的提純產品。
(1)親和層析
將雞卵粘蛋白－Sephadex-G75裝柱（1×10cm）,用pH7.5,0.1M含 0.5M KCL,0.05M CaCL2的緩衝液平衡，平衡約2－3倍的柱體積。將粗胰酶液上柱層析。用紫外蛋白監測儀280nm處檢測蛋白質吸收峰，隨著上柱和流出的雜蛋白量的平衡，吸收峰達到穩定，一旦上柱的胰蛋白酶量超過柱的負荷時，則胰蛋白酶溢出，使吸收峰升高，此時應停止樣品上樣，改用pH7.5的平衡緩衝液衝洗出雜蛋白，待洗出液的吸收回到基線後，改用0.1N的甲酸鉀0.5M KCL,Ph2.5的洗脫液解析，柱的流速維持在1.5ml/min左右，收集洗脫下來的蛋白峰蛋白，測總蛋白量及比活性，並根據上柱樣品的總蛋白量和比活性計算經親和層析後胰蛋白酶比活性提高的倍數，總蛋白回收率，胰蛋白酶量。
當胰蛋白酶峰洗出，待紫外吸收回到基線後，重新用緩衝液平衡，親和層析柱可以反覆使用。
（2）胰酶蛋白和活性測定
本網站所有註明「來源：生物谷」或「來源：bioon」的文字、圖片和音視頻資料，版權均屬於生物谷網站所有。非經授權，任何媒體、網站或個人不得轉載，否則將追究法律責任。取得書面授權轉載時，須註明「來源：生物谷」。其它來源的文章系轉載文章，本網所有轉載文章系出於傳遞更多信息之目的，轉載內容不代表本站立場。不希望被轉載的媒體或個人可與
我們聯繫，我們將立即進行刪除處理。
溫馨提示：87%用戶都在
生物谷APP上閱讀，掃描立刻下載! 天天精彩！