純化任何來源的抗體和抗體片段的顯著優勢是，可以獲得有關靶分子和主要汙染物特性的大量信息。當存在免疫特異性相互作用時，親和色譜法（AC）通常是第一有時是唯一的步驟。但是，為了獲得令人滿意的樣品均勻性，可能需要進一步的精純（polish）步驟，通常是尺寸排阻色譜法。親和純化提供了高選擇性，通常對目標蛋白具有高載量。將目標分子濃縮到較小的體積，一步即可獲得高於95％的純度。最常用的蛋白質製備純化方法都涉及到色譜分析。該方法根據待純化蛋白(目標蛋白)的性質與樣品中其他物質性質的差異進行分離。表1給出了不同色譜方法中使用的蛋白質性質的例子。
表1 用於色譜純化的蛋白質性質
當目標蛋白被親和標記時，AC是通常的第一個純化步驟。如果需要進一步淨化，可以使用其他方法除去殘留的雜質。未標記蛋白的純化通常需要使用多個純化步驟，並按適當的順序應用不同的方法。
AC通過目標蛋白(或蛋白組)與色譜基質上的特定配體之間的可逆相互作用來分離蛋白質(圖1)。交互可以是生物特異性的,例如, 抗體結合蛋白A或受體結合激素，,或非生物特異性的,例如,蛋白質綁定一個染料物質或含有組氨酸的蛋白質與金屬離子結合。AC提供高解析度和高載量。洗脫通常可以在溫和的條件下進行。表2顯示了親和層析的常用標籤。
圖 1 AC示意圖
表 2 親和層析的常用標籤
在AC中，目標蛋白被一種互補的結合物質(配體)特異性地、可逆地結合。樣品在有利於與配體特異性結合的條件下使用。未結合的物質被從柱中洗出，結合的目標蛋白通過改變條件使其有利於洗脫而被回收。洗脫是專門進行的，使用競爭性配體，或非專門的，通過改變，例如，pH值，離子強度，或極性。靶蛋白以純化和濃縮的形式洗脫。分離的關鍵操數如圖2.
圖 2 典型的親和純化
1、結合不同IgG的Protein A和Protein G
蛋白G和蛋白A對多克隆和單克隆IgG型抗體Fc區域的高親和力，為純化IgG、含Fc區域的IgG片段和IgG亞類奠定了基礎。蛋白G和蛋白A分別是來自G群鏈球菌和金黃色葡萄球菌的細菌蛋白。當與Sepharose結合時，蛋白G和蛋白A創造了用於常規抗體純化的非常有用的，易於使用的色譜介質。例如，單克隆IgG型抗體的純化，多克隆IgG及其亞類的純化，免疫複合物IgG的吸附和純化，融合蛋白。IgG亞型可從細胞培養上清、血清和腹水中分離出來。表3比較了蛋白G和蛋白a對不同免疫球蛋白的相對結合強度。結合強度是用游離蛋白G或蛋白A來測試的，可以作為預測與蛋白G或蛋白A的結合行為的指南。然而，當耦合到親和矩陣時，相互作用可以改變。例如，大鼠IgG1與蛋白G Sepharose結合，但不與蛋白A Sepharose結合。
表 3 競爭性ELISA檢測不同物種抗體對蛋白G和蛋白A的相對結合強度。測定了鹼性磷酸酶與兔IgG結合抑制50%所需的IgG量
2、Protein L與kappa輕鏈的可變區域結合
蛋白L最早從細菌種大鏈球菌表面分離得到，通過免疫球蛋白輕鏈相互作用與免疫球蛋白結合，由此得名。由於重鏈的任何部分都不參與結合相互作用，所以與蛋白A或G相比，蛋白L結合的抗體種類範圍更廣。蛋白L結合所有抗體種類的代表，包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。重組蛋白L有四個結合域，與免疫球蛋白和免疫球蛋白片段的kappa輕鏈可變區結合。蛋白L在人類(1,3,4)和小鼠(kappa 1)中與四種kappa輕鏈亞型中的三種結合。表4為完整的重組蛋白L的結合親和度。
表 4 Protein L結合親和力
3、與Fab kappa或lambda輕鏈的固定區域結合的配體
GE還提供了兩個配體，分別與kappa或lambda輕鏈的恆定區域結合。配體是在釀酒酵母中產生的重組蛋白。配體與色譜介質相結合，是純化kappa和lambda Fab片段的首選配體(分別為KappaSelect和lambda FabSelect)。
1、層析介質
GE提供了一種在大腸桿菌中生長的重組蛋白G，從基因上刪除了原蛋白的蛋白結合區域。該重組蛋白G配體可與Protein G Sepharose 4 Fast Flow 和 Protein G Sepharose High Performance結合。
與Protein G Sepharose 4 Fast Flow相比，Protein G Sepharose High Performance提供更清晰的洗脫峰和更濃縮的抗體洗脫。但是，與Sepharose 4 Fast Flow基質相比Sepharose High Performance的珠粒尺寸更小，性能更好，導致柱背壓增大。因此，Sepharose 4 Fast Flow是首選的放大介質。
天然蛋白A (nProtein A)也可偶聯到Sepharose 4 Fast Flow和Sepharose High Performance，而重組蛋白A (rProtein A)只能偶聯到Sepharose 4 Fast Flow。與天然蛋白A相比，與Sepharose結合的重組蛋白A具有一些潛在的優勢。rProtein A已經被設計成通過硫醚偶聯來支持單點定向固定化，從而增強了IgG的結合能力。此外，在大腸桿菌中產生rProtein A，在驗證的發酵和純化過程中沒有使用人類IgG親和步驟，從而最大限度地降低了人類IgG汙染的風險。
MabSelect系列色譜介質用於從大樣本中捕獲單克隆抗體。重組蛋白A配體的MabSelect是有利於定向偶聯，提供增強的結合能力。
MabSelect SuRe使用一種耐鹼的重組蛋白A配體，這種配體能夠抵抗苛刻的清潔劑(如100到500毫米氫氧化鈉)。
MabSelect Xtra使用與MabSelect相同的重組蛋白A配體，但介質顆粒尺寸更小，孔隙率更大，在更高的流速下增加了動態結合能力。
LX使用與MabSelect SuRe相同的重組蛋白A配體，在延長停留時間時具有很高的動態結合能力，是為高滴度抗體過程開發的。耐鹼性、高容量、低配體洩漏以及剛性基體使MabSelect SuRe LX成為單克隆抗體生產廠家的理想純化選擇。
Capto L是捕獲抗體和抗體片段的親和層析介質。它結合了一個剛性的，高流量的瓊脂糖基質與免疫球蛋白結合的重組蛋白L配體，對抗體的kappa輕鏈的可變區域有很強的親和力。因此，Capto L適用於捕獲多種抗體片段，如Fabs、單鏈可變片段(scFv)和域抗體(Dabs)。
2、磁珠介質
蛋白G和蛋白A (nProtein A)也可作為Mag Sepharose的配體，Mag Sepharose是一種基於高度交聯的瓊脂糖顆粒的順磁珠介質。蛋白G Mag Sepharose和蛋白A Mag Sepharose旨在通過免疫沉澱或下拉應用來簡化靶蛋白的富集。蛋白G Mag Sepharose Xtra和蛋白A Mag Sepharose Xtra磁珠用於從血清和細胞上清液中快速、小規模純化和篩選單克隆和多克隆抗體。Mag Sepharose可以方便地與MagRack 6一起使用，MagRack 6是一種用於微離心管的分離工具，最多可並行處理6個樣品，或MagRack Maxi可濃縮最多50 ml樣品。
Protein A常用於純化和分離IgG。Protein A是一種分離自金黃色葡萄球菌的細胞壁蛋白，分子量42kDa，是一種共價結合肽聚糖的胞壁結合蛋白，是一種具有延展形態的多肽。Protein A主要包括有三個部分：信號肽序列（S），錨定蛋白結構域（X）以及5個串聯的高度同源性結構域（E、D、A、B、C）。其中B區和C區的二級結構分析表明，主要有3個α螺旋構成,與IgG的結合區主要集中於第一個和第二個螺旋。
圖 3 Protein A的結構示意圖
天然Protein A有5個IgG結合域和許多其它的未知功能域。其中5個IgG結合域可以結合哺乳動物IgG的Fc片段，具有很強的特異性親和力。Protein A分子至少可以結合兩個IgG分子。
重組Protein A包含5個高IgG結合域，並去除了其它非主要結合域以降低非特異性結合。C-端新增一個Cysteine，可以單一位點定向偶聯於瓊脂糖基架上，降低與抗體接觸的空間位組，提高載量。
Protein A親和層析介質已經廣泛用於從生物流體或細胞培液中分離純化各種類型的IgG或者IgG片段。實驗已經證明，Protein A和IgG的相互作用僅涉及Fc區域，而不影響Fab片段和抗原的結合。
Protein G是G族鏈球菌的細胞表面蛋白，分子量25kDa，和IGg的Fc區域特異性結合，還能以低親和力與Fab區域特異性結合。相比於Protein A，Protein G可以更廣泛、更強的與更多類型的IgG結合，但是載量比較低。
圖 4 Protein A和Protein G與IgG結合區別
1 樣品準備
抗體來源（微生物培養液）含有大量雜質會干擾純化過程。這些汙染物可使用澄清技術或過濾技術去除，最終使抗體富集。
2 結合
每個配體都有自己的最佳結合特性，如溫度、pH、鹽濃度等，仔細考慮這些條件用於buffer配製，以促進抗體與配基之間的最大結合。
3 洗滌
用足夠的洗滌緩衝液洗滌柱子，除去通過非特異性結合作用粘附在基質或配基上的非特異性組分。可通過添加NaCl，有機溶劑Triton X-100，改變buffer pH等來處理。
4 洗脫
特異性洗脫：加入競爭劑，與抗體競爭結合配基，將抗體從配基上置換下來，需優化競爭劑的濃度確保抗體完全洗脫。
非特異性洗脫：改變buffer pH，離子強度和極性。但是抗體對低pH敏感，非常低的pH導致抗體聚集，可在低溫洗脫或添加鹽，鹽酸胍，尿素或有機溶劑增強洗脫。
(1)介質的選擇A,G or 其他，其結合能力的選擇；
(2)上樣流速儘量小，讓Protein G和抗體有充分的結合時間；
(3)在低pH值洗脫後，快速中和；
(4)長時間保存加入0.02-0.05％疊氮鈉；
(5)加入10%甘油，可有效防止疏水作用引起的；
(6)抗體純度不夠，雜蛋白含量高，易引起蛋白的沉澱。