隨著分子生物學的迅速發展，尤其是基因工程 的進步，越來越多的蛋白質藥物逐漸被開發並應用於疾病治療中，因此掌握將目的蛋白質最快最有效地分離提取純化出來的方法，越來越重要，本文就蛋白質的提取、分離純化作個介紹。
一、蛋白質(包括酶)的提取
大部分蛋白質都可溶於水、稀鹽、稀酸或鹼溶液，少數與脂類結合的蛋白質則溶於乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑中，因些，可採用不同溶劑提取分離和純化蛋白質及酶。
(一)水溶液提取法
稀鹽和緩衝系統的水溶液對蛋白質穩定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利於蛋白質的溶解。提取的溫度要視有效成份性質而定。一方面，多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利於溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質變性失活，因此，基於這一點考慮提取蛋白質和酶時一般採用低溫(5度以下)操作。為了避免蛋白質提取過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑(如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等)。
下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。
1、pH值
蛋白質，酶是具有等電點的兩性電解質，提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH 範圍內。用稀酸或稀鹼提取時，應防止過酸或過鹼而引起蛋白質可解離基團發生變化，從而導致蛋白質構象的不可逆變化，一般來說，鹼性蛋白質用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質用偏鹼性的提取液。
2、鹽濃度
稀鹽濃度可促進蛋白質的溶解，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合，具有保護蛋白質不易變性的優點，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾/升濃度為宜。緩衝液常採用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等鹽溶液。
(二)有機溶劑提取法
一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶，不溶於水、稀鹽溶液、稀酸或稀鹼中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們具有一定的親水性，還有較強的親脂性，是理想的脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別優越，一是因為丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強;二是丁醇兼具親水性，在溶解度範圍內不會引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇範圍較廣，也適用於動植物 及微生物材料。
二、蛋白質的分離純化
蛋白質的分離純化方法很多，主要有：
(一)根據蛋白質溶解度不同的分離方法
1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶;當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出，這種現象稱鹽析。將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子(如硫酸銨的SO42-和NH4+)有很強的水化力，可奪取蛋白質分子 的水化層，使之「失水」，於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好。由於各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱。
影響鹽析的因素有：(1)溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫(4℃)操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶解度降低。但有的蛋白質(如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白)在較高的溫度(25度)比0度時溶解度低，更容易鹽析。(2)pH值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶解度最低。(3)蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來(共沉現象)。因此在鹽析前要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在2.5-3.0%。
蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應用最多的硫酸銨，它的優點是溫度係數小而溶解度大(25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升;0度時飽和溶解度為3.9M，即676克/升)，在這一溶解度範圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來;另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節。
蛋白質在用鹽析沉澱分離後，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入秀析袋內，用緩衝液進行透析，並不斷的更換緩衝液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡聚糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。
2、等電點沉澱法
蛋白質在等電點時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉澱，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。
3、低溫有機溶劑沉澱法
用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低並析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。
(二)根據蛋白質分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。
超濾法是利用高壓力或離心力，強迫水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質被截留，可選擇不同孔徑的濾膜截留不同分子量的蛋白質。
2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡聚糖凝膠(Sephadex gel)和瓊脂糖凝膠(agarose gel)。選擇不同的分子量凝膠可用於脫鹽、置換緩衝液及利用分子量的差異分離不同蛋白質或除去熱源。
(三)根據蛋白質帶電性質進行分離
蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。
1、電泳法
各種蛋白質在同一pH條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體，電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的pH位置就停止，此法可用於分析和製備各種蛋白質。
2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑(如：羧甲基纖維素;CM-纖維素)和陰離子交換劑(二乙氨基乙基纖維素;DEAE纖維素)，當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，溶液pH大於蛋白質的等電點pI時，蛋白質帶負電，用陰離子交換層析，否則相反。隨後用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。
(四)根據配體特異性的分離方法-親和色譜法
親和層析法是分離蛋白質的一種極為有效的方法，它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很複雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體的分子能特異而非共價地結合。
親和層析法的特點是：
1. 結合效率高，分離速度快。配基可是酶的底物、抑制劑、輔因子、特異性的抗體;
2. 吸附後可用改變緩衝液的離子強度和pH的方法，將目標蛋白洗脫下來，也可用更高濃度的同一配體溶液或用與配體親和力更強的溶液洗脫。
3. 依親和選擇性的高低分為：基團性親和層析，固定相上的配基對某一類基團的極強的親和力。如含有糖基的一類蛋白質或糖蛋白對三嗪染料顯示特別強的吸附能力;高選擇性(專一性)親和層析，配基僅對某一種蛋白質有特別強的親和性。如單克隆抗體對抗原的特異性的吸附。
4. 親和層析除特異性的吸附外，仍然會因分子的錯誤識別和分子間非選擇性的作用力而吸附一些雜蛋白質，令洗脫過程中的配體不可避免的脫落進入分離體系。
親和層析法按配基的不同可分為：
(1)金屬螯合介質
過渡金屬離子Cu2+、Zn2+和Ni 2+等以亞胺絡合物的形式鍵合到固定相上，由於這些金屬離子與色氨酸、組氨酸和半胱氨酸之間形成了配價鍵，從而形成了亞胺金屬—蛋白螯合物，使含有這些胺基酸的蛋白被這種金屬螯合親和色譜的固定相吸附。螯合物的穩定性受單個組氨酸和半胱氨酸解離常數所控制，從而亦受流動相的pH和溫度的影響，控制條件可以使不同蛋白質相互分離：例如減少洗脫液的pH;競爭洗脫，可用不同濃度的咪唑，組氨酸，氯化銨或其他能與金屬離子結合的試劑洗脫。
(2)小配體親和介質
配體有精氨酸、苯甲醯胺、鈣調因子、肝素和賴氨酸等等。
(3)抗體親和介質
即免疫親和層析，配體有重組蛋白A和重組蛋白G，但蛋白A比蛋白G專一，蛋白G能結合更多不同源的IgG。
(4)顏料親和介質
染料層析的效果除主要取決於染料配基與蛋白的親和力大小外，還與洗脫緩衝液的種類、離子強度、pH值及待分離的樣品的純度有關。配體有Cibacron Blue和Procion Red兩種。在一定的條件下，固定化的染料能起陽離子交換劑的作用，為了避免此現象的發生，最好要離子強度小於0.1和pH大於7時操作。主要用於純化蛋白、幹擾素、凝血因子等。
(5)外源凝集素親和介質
配體有刀豆球蛋白、扁豆外源凝集素和麥芽外源凝集素，固定相外源凝集素能和數種糖類殘基發生可逆反應，適合純化多糖、糖蛋白、膜蛋白等。
(6)核酸親和介質
配體有AMP，polyA(U)等，純化NADP+ 依賴脫氫酶和其他對NADP+有親和作用的酶，或純化mRNA-結合蛋白，聚合酶，mRNA,逆轉錄酶等。
(五)根據蛋白質的疏水性差異
多數疏水性的胺基酸殘基藏在蛋白質的內部，但也有一些在表面。蛋白質表面的疏水性胺基酸殘基的數目和空間分布決定了該蛋白質是否具有與疏水柱填料結合，從而利用它來進行分離的能力。
高濃度鹽水溶液蛋白質在柱上保留，在低鹽或水溶液蛋白質從柱上被洗脫，故特別適用於濃硫酸銨溶液沉澱分離後的溶液以及該沉澱用鹽溶解後的含有目標產品的溶液直接進樣到柱上，當然也適用7mol/鹽酸胍或8mol/L脲的大腸桿菌表達的蛋白質提取液直接進樣到柱上，在分離的同時也進行了復性。
(六)基因工程構建的純化標記
通過改變 cDNA在被表達的蛋白的氨基端或羧基端加入少許幾個額外胺基酸，這個加入的標記可用來作為一個有效的純化依據。
1. GST融合載體
使要表達的蛋白質和穀胱甘肽S轉移酶一起表達，然後利用Glutathione Sepharose 4B作親和純化，再利用凝血酶或因子Xa切開。
2. 蛋白A融合載體
使要表達的蛋白和蛋白A的IgG結合部位融合在一起表達，以IgG Sepharose純化。
3. 含組氨酸標記(Histidine-tagged)Chelating Sepharose
最通行的標記之一，是在蛋白質的氨基端加上6～10個組氨酸，在一般或變性條件(如8M尿素)下藉助它能與Ni2+螯合柱緊緊結合的能力，用咪唑等洗脫，或將pH降至5.9(pH4-6是一個能很好分離蛋白的區間，也用到pH3-4)使組氨酸充分質子化，不再與結合Ni2+使之得以純化。
蛋白質在組織或細胞中是以複雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離(Separation)，提純(Purification)和鑑定(Characterization)是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從複雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往採取幾種方法聯合使用。
最後提醒一下，蛋白質的分離提取純化是生物化學的一個重要組成部分，不過由於蛋白質廣泛分布於各種不同類型的細胞核組織中，目前尚無特別簡單便捷快速的方法一次性將一種蛋白提取純化出來，往往需聯合幾種方法使用才行。