摘要
100mM ph3.5醋酸一步法洗脫ProA柱，先是隨著PH降低形成了一個線性梯度，然後逐漸接近終點。IgG初始水動力直徑是11.5nm，PH6.0洗脫直徑為9.4nm,IgG的大小在峰值處繼續減小，直到PH3.9時達到最大2.2nm，早期洗脫的IgG二級結構只有輕微的影響，但之後洗脫過程中2.2nm IgG中β片層和最低不規則圈狀結構佔所有結構中最高的比例。洗脫峰部分IgG尺寸的縮減和結構的變化歸因於高濃度的IgG在低PH 和導電性下減小了尺寸構像，IgG與ProA相互作用後促進IgG結構變鬆弛。當洗脫液接近PH3.5洗脫時，IgG的尺寸會變為10.4nm,β片層損失，α螺旋會增加，同時不規則的捲曲也會出現。之後洗脫的這些類群歸因於從兩個不同的結合位點ProA上洗脫下來，FC端兩邊各有一個鍵，這會使得它有更高的解離常數比單個的ProA FC端結合，就需要更惡劣的條件去洗脫，構象高度的破壞歸因於兩個重鏈與ProA相互作用。
關鍵詞：ProA、洗脫、構象改變、IgG尺寸、IgG濃度
引言
ProA親和層析純化的IgG構象一直被認為是天然結構，這在最近的研究中被確認1，IgG洗脫過的ProA在生理條件下的滴定顯示它的大小和二級結構與在使用ProA之前是一樣的。但意外的是，抗體在洗脫過程中它的構象經過了短暫的變化，同時伴隨著平均水動力直徑的減小從11.5nm到5.5nm。這個結果就解釋了ProA 影響上部IgG二級結構不穩定的現象[2,3]，以及低PH作用下變性的作用[4–9]。
儘管這個解釋看起來很吸引人，但是它還是過於簡單化，沒有反應出進一步的相關性，通過超速離心和X射線/中子掃描建模顯示濃度與IgG大小的依賴性[10]。研究表明100g/L的IgG水溶液在低PH下尺寸構象被減小[11,12]，從ProA上洗脫下來的IgG 都具有在低PH和低導電性下聚集體會增多的特點。IgG的大小和濃度和洗脫條件相關，這可能導致了前期ProA研發的報導結果[1]。
我們是在更詳細的水平上修正了ProA親和層析過程中IgG 的大小和構象變化，之前是針對於洗脫下來的IgG作為單一的研究對象，而我們這次是在整個洗脫峰上研究大小和二級結構。
還考慮到單獨的IgG分子與ProA在柱上怎樣發生作用的，IgG與ProA上主要結合位點是在FC結構域上的第二和第三疏水結構之間的間隙[2,3]。在每個重鏈上都有一條，這給IgG 結合ProA提供了更多的可能[13],具有影響其洗脫特性的潛力，以及不同洗脫特性使得洗脫亞群暴露在不同的條件下的可能。
2 材料與方法
2.1 設備試劑以及實驗材料配置
緩衝液，鹽，和試劑均來自Sigma–Aldrich(St. Louis, MO)除了尿囊素是來自Merk Millipore(Darmstadt, Germany)Toyoprarl AF-rProA-56F 是來自 Tosoh Bioscience (Tokyo). UNOsphereTMQ 是來自 Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA).UNOsphereTMQ 是來自 Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA).Chro-matography media 是來自 XK or TricornTMseries columns(GE Healthcare). Chromatography experiments是來自an KTATMExplorer 100 or Avant 25 (GE Healthcare).採用Ho等人研發的三維模型用中國倉鼠卵巢細胞培養表達了一種具有生物相似性的IgG單克隆抗體(CHO, DG44, Life Technologies, Carlsbad, CA) [14]，抗體是在5L 玻璃攪拌發生器BIOSTATB(SartoriusStedim Biotech) 採用無血清培養基，補料分批培養等量的 CD CHO(Life Technologies) 和HyQPF (GE Healthcare)，在活率在30%-50%的時候可以收穫，為了防止細胞分裂的可能性避免使用泵收。通過離心過濾去除細胞，在上清液裡面加加入辛酸使其濃度為0.4%，和尿囊素使其最終的濃度為1%。用1M醋酸將PH調節到5.3然後攪拌混勻2h, 50mM MES預平衡UNOsphere Q ,再加入ph 5.3 150mM NaCl 按照總體積為5% 混勻至少4h,固體通過離心和過濾的方法去除。
用於本實驗的IgG是用ProA 親和層析純化，在20ml 層析介質裝在 XK 16/20 體積的柱子，線性流速為300cm/h，用5CV 50mM HEPS,120mM NaCl,PH7.0(HBS)平衡，500ml 細胞培養上清加載到柱子上，並用8CV HBS洗滌後再用PH 8.0 50mM Tris洗滌第二次。抗體是用ph3.5 100mM乙酸一步法洗脫，蛋白在UV值在280nm達到50mAU的點到低於這個點收集，然後用0.1M NaOH 洗滌20CV柱子. 聚集體，抗體片段，DNA和宿主細胞蛋白通過陰離子交換進一步純化去除（PH 8 1M NaCl）1.5g IgG 到150ml的 Capto adhere col-umn (XK 26/40, linear flow rate 280 cm/h)平衡緩衝液50mM Tris,1M NaCl,PH8.0,平衡緩衝液洗滌10CV,抗體用50 mM MES,0.35 M NaCl, pH 6.0一步洗脫。
2.2 實驗方法
IgG 在12ml (XK 16/20 column, 6 cm bed height)柱子上純化，線性流速300cm/h，柱子平衡，洗滌，洗脫都和上面的一樣，從吸光度在280nm 達到50mAU到低於50mAU收集了3ml 樣品，大多數的實驗是 IgG 在柱子上高於承載量5%的條件下，產量可以達到25g/L.
以乙酸為緩衝液，NaOH滴定以獲得最低的導電性，用於PH梯度線性起始洗脫緩衝液是20mM HEPES,20mM MES,20mM乙酸，PH7.0,最後的洗脫液20 mM HEPES,20 mM MES, 20 mM acetate, pH 3.0.這種梯度緩衝液的選擇是由於他們低導電性所決定的，MES和HEPES都是兩性離子，不具有導電性，20mM的醋酸的濃度小於0.2mS/cm。
將層析柱裝至它體積的50%後，在用PH4.4洗脫液洗脫的時候，IgG的濃度是由柱上面不同的層階所決定的，然後IgG收集在ph3.0 100mM醋酸中定量。
2.3 分析方法
測量IgG濃度的方法是參考了文獻1。簡而言之，HCP的含量是用三代 CHO HCP 試劑盒測試 ELISA
的方法確定的. (Southport, NC)，DNA是用a QX100TMDroplet DigitalTMPCR System (Bio-Rad Laboratories)確定，聚集體含量是通過G3000SWxl column (Tosoh Bioscience) SEC和ionexUltiMateTM3000 LC system (Thermo Scientific)分析。
溶質中自由離子的大小是用DLS ZS表徵(MalvernInstruments, Worcestershire, UK),200ul的樣品溫和的混勻10S在渦旋儀後放入一個石英管(ZEN2112, Malvern Instruments)，使用尖底的塑料管防止有泡沫產生。用ASV-10粘度計測量溶液中-粘性物質的含量(A&D Company, Tokyo)，在173°測定反向散射光，三次實驗結果求平均值，衰減指數維持在7-8，使用廠家提供的7.02版本的軟體處理數據。
元二色譜使用的是JASCO J-810 (JASCO Corp., Tokyo)，IgG 濃度為200ug/ml 時使用路徑為0.1cm的石英試管遠紫外光譜在190-260nm之間，稀釋劑的組成要匹配單個測試樣品的PH，導電性，除了IgG,最大限度的減少對二級結構的破壞。累計32次掃描，掃描速率為100nm/min,時間為0.125s.所有的光譜是通過減去緩衝液的的值和32次數據的平均值。所有的實驗是在常溫下進行。相對不規則的捲曲、α螺旋和β片層的含量都用K2D2軟體計算[15]。其他實驗的細節會在接下來的章節描述或者重複。
3 結果和討論
本實驗研究所用的抗體和最初報導中提到ProA 洗脫中能夠減小尺寸的的抗體是一樣的，因為在那個實驗中，實驗使用的是IgG1亞型，天然水動力直徑是11.5nm, 宿主細胞蛋白含量小於1ppm,宿主DNA小於1ppb, 聚合體小於0.1% 以減小其他的幹擾風險，能夠證明IgG 從ProA洗脫下來後和汙染物之間的關係是穩定的[16]。大的汙染物會在DLS 造成偽影使其在同一樣本中較小的物種會明顯的膨脹[1,17–19]。
DLS專門確定抗體的大小是因為抗體在經過排阻層析介質的時候，因為低PH和導電性會阻止非特異性的結合[1].
3.1 通過一步洗脫改變IgG大小和構象
圖1：經過ProA洗脫峰IgG大小證明了IgG的異質性，抗體加載到25mg/ml時代表它柱子最大承載能力的5%。洗脫液ph3.5 100mM乙酸，根據ProA(pI 5.0 [20,21])和乙酸(pKa4.75)緩衝液的特性，在洗脫過程中PH下降曲線是符合當初的預期的，PH快速的降低是因為它替代了洗滌緩衝液，然後逐漸降低到接近終點PH值。最初IgG在PH6.0洗脫部分時水動力直徑是9.4nm,大小隨PH減小而減小，直到達到最小的直徑2.2nm當PH降低到3.9的時候。IgG的大小隨後溫度升高到10.4當PH為3.5的時候。
圖2：比較CD光譜和二級結構的比例，發現隨著IgG的收集增多α螺旋的比例是略有增加，β片層和不規則線圈是下降的。這個結果表明天然的抗體結構是比較保守的。
對比原始抗體和2.2nm的群體顯示二級結構的增加，β片層是所有構象中最多的，它從10.5%升高到16.2%，α螺旋大約上升四分之一從36.2%到49.1%，不規則線圈大約下降了四分之一，從53.4%降到34.5%，這些實驗結果證明，雖然這些結構不是天然的，但仍然是穩定的中間體。
從尾部收集到的10.4nm的IgG二級結構被嚴重的修改，它主要的特點是降低了β片層的含量到5.7%，這表明β片層在原始的抗體中降低了一半，在2.2nm的結構中降低了2/3。相反的，α螺旋結構在佔比最多56%，不規則線圈從38.4%降低到34.5% 在2.2nm 結構中，但是依然低於它在原始抗體分子中的52.4%，這些結果集中表明在PH3.5的時候，原始結構的損失是隨著尺寸的增加造成過量的α螺旋結構伸展成軸型蛋白。
3.2線性梯度洗脫改變IgG構象
圖3：相同的計量相同的IgG在同一個柱子上洗脫的PH梯度曲線圖，IgG開始洗脫時的pH為4.7，而在一步洗脫的時候是6.0. IgG表觀的明顯不同是因為不同的PH洗脫梯度不同，考慮到一步法是直接從柱頂部立即洗脫下來，因為沒有被捕獲的IgG在層析中比其他的離子快速，所以IgG在未達到與配體分離條件之前出來，線性梯度洗脫會更加精確的指出 IgG 與配體分離的條件，因此與一步法進出口條件的區別會發現逐步的改變條件會減小進口和出口條件的差異。
IgG大小的改變和PH梯度洗脫液的變化是一致的在一步法中，IgG尺寸明顯的減小是在經過主峰的時候，在尾部洗脫的時候是在增加的，這就是與一步法最大的區別。大小隨著PH變化的幅度在線性梯度中小的多，但是在一步法中高很多，這兩個圖之間的差異表明除了PH還有一個或者多個因素的影響。之前的研究表明ProA介質的變性是因為PH的影響 [1]，但這對兩種洗脫方式的影響應該是相同的。
3.3 IgG濃度對IgG大小的影響
圖4突出顯示了兩種不同洗脫方式IgG濃度偏移曲線，洗脫以後再測定濃度因為在洗脫過程中在主峰的時候UV值達到飽和了對其造成幹擾，IgG的濃度影響大小似乎是沒有科學原理之前也沒有報導，但是在其他新興領域的研究表明，在特定環境下抗體的大小會隨著抗體濃度的變化而有顯著的變化。
最近的研究表明IgG1型單克隆抗體的水溶液的濃度在達到100g/的時候大小會急劇減小[11,12]，較低的PH值會增加其影響，導致PH4.5的時候IgG的大小變為2nm.類似的IgG4單克隆抗體也會降低，但是開始濃度只有2.5mg/ml[10]. 大小和二級結構的詳細描述是基於超濾和中子/X射線，研究人員認為這種影響是通過不間斷的碰撞機制，這種高速的碰撞使其擁有更加緊湊的結構。
儘管它們之間的相同點是提高抗體濃度，但是IgG1和IgG4的至少在機制上是不同的，IgG4的結果顯示它是不依賴NaCl的濃度[10]，IgG1的大小嚴重依賴於低的導電性[11,12]。之前的研究報導了ProA IgG1尺寸的減小也依賴於低的導電性[1]。NaCl的提高會使得IgG1的尺寸增加，即便IgG的濃度達到20mg/ml，它在生理配方中的大小還會保持與原來的大小。
考慮到配方研究中從ProA上洗脫條件與觀察到IgG尺寸的減小相同的條件，認為這種條件對ProA增加相同的影響似乎是合理的。這似乎可以解釋在兩種洗脫條件下經過主峰的時候抗體大小減小的原因。這也可以解釋圖4中一步法和線性梯度法曲線的偏移，線性梯度法低濃度的IgG 造成IgG尺寸的變小程度小於一步法較高濃度的洗脫。
這一解釋的明顯缺陷是2.2nm構象僅在7g/L時洗脫，這似乎低於促進IgG1尺寸減小的閾值[11,12]，但是IgG4的研究發現了一種調整這種差異的現象。IgG4具有比IgG1更加柔軟的構象。即便在低濃度下，它也容易和FC結合的Fab區域配對來覆蓋和阻斷補體激活的位點[10]。ProA與IgG1之間的作用是發生在第二區域的上三分之處向上延伸到鉸鏈區，同時也具有增加分子間柔韌性的作用[2,3].可能ProA與IgG的相互作用增加了柔韌性這就降低了尺寸改變的濃度閾值。
3.4 在洗脫結尾時IgG尺寸的增加
IgG在洗脫結尾時的尺寸的增大是源於一種特殊的機制，這表明它的二級結構有嚴重的變性，但是這不能夠解釋為什麼這些結構洗會晚一些洗脫下來。高程度的變性被認為是可以更高效的分離生物親和力作用。這應該是是更早的洗脫而不是更晚的洗脫下來。有趣的是它自己本身的結構顯示調節了這種明顯的衝突。
最初與Pro A結合的位點是在重鏈第二和第三結構域疏水區之間[2,3]。因為抗體分子是對稱的，因此在每條重鏈上都有這樣一個結合位點。這個機制會造成結合一個或者兩個位點的可能性，雙位點結合在ProA柱上的增加了解離困難，所以會洗脫下來的晚一些[13]. 這也是比較明顯的結果如果抗體與衣蛾ProA分子結合，那麼它會造成抗體分子構象的改變，如果與兩個ProA分子結合，那麼它更加會破壞抗體構象。
ProA上展示的配體促進了雙位點的結合[13].通常情況下ProA就如觸角一樣存在經過一些商業化的固定工序它就如毛刷上面的毛一樣樹立在層次介質表面。單個的結合位點是柔軟的，一個ProA分子上結合4-5個被不規則捲曲連結在一起的IgG.他們被牽引移動，它們與配體之間的間距是由於它們本身在生理PH條件IgG所帶的負電荷之間的靜電相互排斥所導致的[20,21]。
這就產生了一個這樣的預期，首先進入層析柱的IgG很可能會結合兩個位點，先結合一個，在結合另外一個。每一個這樣的分子交叉連接在ProA配體上。之後進入的IgG就會遇到比較少的結合位點，所以就必須要與克服已被結合的這種限制再去結合。兩個位點結合的頻率就會隨著繼續加載量的增加而減少，這樣會隨著柱子的飽和單個位點結合的IgG會增多。
25%柱床體積的柱子加載IgG後發現在末端的洗脫峰大致對稱。這些峰被認為是結合了兩個位點的IgG.但是在50%DBC上面的峰明顯不對稱，且在前面較緩的斜坡有雙峰的跡象。在100% DBC有明顯的雙峰，早期洗脫下來單個結合位點的IgG與之後洗脫下來雙個結合位點的IgG相重疊。
這些發現明顯的解釋了雙結合位點的IgG有著更大的解離常數，應該從單個位點結合的IgG中需要兩步才能洗脫下來，這個就在圖6可以證明，100%，50%，25%DBC結果顯示。最初ph4.4可以洗脫100%DBC上最大的峰，這說明是單個位點結合在柱子上的，同樣的條件可以再50%DBC上洗脫下來少量的IgG,這證明在50%大多數的IgG是雙位點結合的，PH4.4在25%DBC沒有洗下來IgG,這說明在25%DBC上全部是雙位點結合。其他剩餘的IgG應該是雙位點結合需要更進一步的PH3.5來洗脫。
IgG經過垂直層析柱的特性應該更深入的了解，IgG在經過加載和洗滌之後都集中在柱子頂端（如圖7）。在經過ph4.4洗脫以後他們會以低濃度的形式均勻的分布在整個柱長上。這說明在ph4.4的時候單個結合位點的IgG開始從柱子上分離，但同時有些IgG會在下遊的不飽和區重新結合成雙結合位點，這個在25%DBC加載的時候顯示（圖6）最初有一些單個位點的IgG在PH4.4洗脫後被雙位點重新捕獲。IgG加載的越高,大多數雙結合位點的IgG已經分離的時候會減小單個位點重新結合的機率，就如圖6中顯示的一樣。
3.5. Denaturation or facilitation?
ProA親和層析特別是酸洗步驟，會使得抗體變性有很長的爭議[2–9,13,22]。這就意外著ProA對抗體的影響是有破壞作用的，目前的結果是支持這一觀點的。然而與最近其他的研究對比，ProA促進了IgG原有的構象模型。之前的研究發現ProA與酶底物之間的相互作用是相一致的[1]。與ProA結合使得構象改變被當做是一個擬合的例子。PH3.5洗脫使其構象的改變往往與更低的PH相關（不依賴ProA）被看作是ProA降低這些特定構象活化的一個例子[1]。這顯然是ProA在低濃度抗體下促進抗體的大小，同時是另外一個減小構象改變所需要的活化能力的例子。（如圖8）
通過在尾部洗脫條件下抗體二級結構的損傷可以直接的證明ProA對其實有損害的，但是這個影響是短暫的，在生理條件下完全可逆，甚至放在PH3.5條件下7天以後也是可逆的[1]。這似乎是公平的即便在最後的洗脫中有大量的IgG 正常範圍內的構象改變行為。
短暫的構象改變也只是一個潛在的問題，除了大小的改變和非二級結構出現，在洗脫條件下，ProA上洗脫下來的IgG仍然具有很高的非特異性結合性[16]，除了IgG和ProA的結合外這項技術還涉及到了很多的變量。ProA也會結合一些染色質和其他宿主汙染物，IgG在洗脫過程中與汙染物相互作用促進它的聚集[1,16,23,24。從ProA 洗脫下來構象改變了的IgG比天然的IgG更容易集聚，在天然IgG不聚合的條件下形成更持久的聚集[1,16]。Mazzer等人[25]發現在純化IgG4的過程中在進行低PH病毒滅火的時候 IgG有不同程度的聚集。Shukla等人[26]也發表說ProA 在低PH條件下會促進聚集體形成。
具體的說目前的觀察對這種想像的影響有待進一步的驗證，但這個有價值的結論是顯而易見的：ProA作為一個研究抗體尺寸和構象變化的工具。這為更好的理解ProA層析方面提供了希望，同時可能也會為更具有價值的解決方案提供了可能。這項研究除了ProA，更重要的是讓人們對IgG結構可塑性有比之前原本更多的了解。任何濃縮IgG並暴露於低PH與導電性環境中的純化技術都可能造成影響，但是對於ProA,IgG與其配基的相互左右會更加增強這個可能。具有濃度依賴的構象改變應該是除了IgG以外其他蛋白的共同特性。
4 結論
IgG1型抗體尺寸和構象的改變是與ProA 配基的相互作用，IgG濃度，低的PH和導電性有關係的。IgG在洗脫最前的圖譜中水動力直徑是9.4nm,二級結構破壞比較小。在洗脫主峰上是直徑最小達到了2.2nm，有最高的非原始二級結構出現。尺寸減小主要是由於高濃度，低PH和導電性造成了IgG直徑減小的趨勢。在最初的ProA和抗體相互作用的時候促進和過渡使其在合適的濃度下造成破壞。二級結構在洗脫結尾造成的破壞相應的增加了抗體的大小，這顯然是由於α螺旋過度伸長所造成的水動力軸。在洗脫結尾的部分是因為抗體是兩個結合位點結合在ProA上，FC端每一邊結合一個它造成了更高的解離常數，要使用更惡劣的條件才能洗脫下來。這種構象高度的改變是因為兩條重鏈同時與ProA配基相互作用的結果。
References：
[1]P. Gagnon, R. Nian, D. Leong, A. Hoi, Transient conformational modification ofIgG during purification by protein A affinity chromatography, J. Chromatogr. A1395 (2015) 136–142
.[2] J. Deisenhofer, Crystallographic refinement and atomic models of a human Fcfragment ant its complex with fragment B of protein A from Staphylococcusaureus at 2.9 and 2.8 resolution, Biochemistry 20 (1981) 2361–2370.
[3] J. Deisenhofer, T. Jones, R. Huber, J. Sjdahl, J. Sjquist, Crystallization, crystalstructure analysis and atomic model of the complex formed by a human Fcfragment and fragment B of protein A from Staphylococcus aureus,Hoppe-Seylars Z. Physiol. Chem. 359 (1978) 975–985.
[4] T. Arakawa, J. Philo, K. Tsumoto, R. Yumioka, D. Ejima, Elution of antibodiesfrom a protein-A column by aqueous arginine solutions, Protein Expr. Purif.36 (2004) 244–248
[5] B. Baynes, D. Wang, B. Trout, The role of arginine in the stabilization ofproteins against aggregation, Biochemistry 44 (2005) 4919–4925.
[6] R. Latypov, S. Hogan, H. Law, H. Gadgil, D. Liu, Elucidation of acid-inducedunfolding and aggregation of human immunoglobulin IgG1 and IgG2 Fc, J.Biol. Chem. 287 (2012) 1381–1396.
[7] M. Thies, R. Kammermeier, K. Richter, J. Buchner, The alternatively foldedstate of the antibody CH3 domain, J. Mol. Biol. 309 (2001) 1077–1085.
[8] J. Buchner, M. Renner, H. Lilie, H.J. Hinz, R. Jaenicke, T. Kiefhabel, R. Rudolph,Alternatively folded states of an immunoglobulin, Biochemistry 30 (1991)6922–6929
[9] S. Martsev, Z. Krachuk, A. Vlasov, G. Lyakhnovich, Thermodynamic andfunctional characterization of a stable conformer obtained by renaturationfrom a partially structured low pH-induced state, FEBS Lett. 361 (1995)173–175.
[10] L. Rayner, G.K. Hui, J. Gor, R. Heenan, P. Dalby, S. Perkins, The Fabconformations of human immunoglobulin G4 (IgG4) restrict access to its Fcregion: implications for functional activity, J. Biol. Chem. 289 (2014)20740–20756.
[11] W., Fraunhofer, A., Bartl, H.J., Krause, M., Tschoepe, K., Kaleta, Antibodyformulations and methods of making same, United States Patent US 8,420,081B2, 2013, p. 1–119.
[12] D. Dong, Impact of ion-mAb interactions on the UFDF process: towardsprocess and product design, in: Oral presentation at the BioprocessInternational Conference and Exhibition, Boston, 2015.
[13] P. Gagnon, Purification tools for monoclonal antibodies, validated biosystems,Tucson (1996) 155–198.
[14] S.C. Ho, M. Bardor, H. Feng, Mariati, Y.W. Tong, Z. Song, M.G.S. Yap, Y.S. Yang,IRES-mediated Tricistronic vectors for enhancing generation of highmonoclonal antibody expressing CHO cell lines, J. Biotechnol.
157 (2012)130–139.[15] C. Perez-Iratxeta, M. Andrade-Navarro, K2D2: estimation of protein secondarystructure from circular dichroism spectra, BMC Struct. Biol. 8 (2005) 25.
[16] P. Gagnon, R. Nian, Y.S. Yang, Q. Yang, C.L. Lim, Non-immunospecificassociation of immunoglobulin G with chromatin during elution from proteinA inflates host contamination aggregate content, and antibody loss, J.Chromatogr. A 1408 (2015) 151–160.
[17] K. Stulik, V. Pacakova, M. Ticha, Some potentialities and drawbacks ofcontemporary size-exclusion chromatography, J. Biochem. Biophys. Met. 56(2003) 1–13.
[18] T. Arakawa, D. Ejima, T. Li, J. Philo, The critical role of mobile phasecomposition in size exclusion chromatography of protein pharmaceuticals, J.Pharm. Sci. 99 (2010) 1674–1692.
[19] K. Ahrer, A. Buchacher, G. Iberer, A. Jungbauer, Analysis of aggregates ofhuman immunoglobulin G using size exclusion chromatography, static anddynamic light scattering, J. Chromatogr. A 1009 (2003) 89–96.
[20] I. Bjrck, B. Petersson, J. Sjquist, Some physicochemical properties of proteinA from Staphylococcus aureus, Eur. J. Biochem. 29 (1972) 579–584.
[21] J. Langone, Protein A of Staphylococcus aureus and related immunoglobulinreceptors produced by streptococci and pneumococci, Adv. Immunol. 32(1982) 157–252.
[22] S. Vunnum, G. Vedantham, B. Hubbard, Protein A-based affinitychromatography, in: U. Gottschalk (Ed.), Process Scale Purification ofAntibodies, J. Wiley and Sons, Hoboken, 2009, pp. 79–102.
[23] P. Gagnon, R. Nian, J. Lee, L. Tan, S.M. Abdul-Latiff, C.L. Lim, C. Chuah, X. Bi, Y.S.Yang, W. Zhang, H.T. Gan, Nonspecific interactions of chromatin withimmunoglobulin G and protein A, and their impact on purificationperformance, J. Chromatogr. A 1340 (2014) 68–78.
[24] R. Nian, P. Gagnon, Advance chromatin extraction inproves captureperformance by protein A affinity chromatography, J. Chromatogr. A (2015),http://dx.doi.org/10.1016/j.chroma.2015.12.044.
[25] A. Mazzer, X. Perraud, J. Halley, J. O』Hara, D. Bracewell, Protein Achromatography increases monoclonal antibody aggregation rate duringsubsequent low pH virus inactivation hold, J. Chromatogr. A 1415 (2015)83–90.
[26] A. Shukla, P. Gupta, X. Han, Protein aggregation kinetics during protein Achromatography: a case study for an Fc fusion protein, J. Chromatogr. A 1171(2007) 22–28.