下遊純化技術的新方向

2021-01-20 Cytiva思拓凡
自1997年FDA批准第一個治療淋巴癌的嵌合單抗藥物Rituxan, Anti-CD20至今，FDA批准的治療性單抗藥物，約一半用於治療癌症，多個已成為年銷售額超10億美元的「炸彈藥物」。而隨著高細胞密度培養及表達技術的不斷發展，大規模培養的抗體表達水平從1g/L提高到15g/L；上遊發酵規模越來越大從12000 L擴大到20000 L；為了達到生產需求，可能多條生產線並行運行，上遊技術的發展及生產規模的擴大對抗體純化的下遊工藝也提出了新的挑戰。為了迎合上遊發展和市場需求，兩步法純化抗體純化平臺、連續流技術以及纖維層析技術應運而生。
單克隆抗體是一類結構類似的蛋白，以protein A親和捕獲為主的下遊純化平臺工藝已經相當成熟。經典三步法包括親和捕獲-陽離子交換層析-陰離子交換層析（見圖Fig1左）。

其中，protein A親和層析可以特異性的、快速捕獲目標抗體，一步純化即可達到95%以上的純度；

陽離子交換層析是對解析度要求非常高的步驟，通常選擇細粒徑的高解析度陽離子填料，通過結合洗脫模式來分離產品相關雜質，比如聚集體、電荷異構體等；

最後一步陰離子以流穿模式進行精細純化，控制核酸、內毒素、病毒等工藝相關雜質。

如果通過細胞株篩選以及上遊細胞培養條件的優化可以獲得高質量的發酵液，那麼下遊的純化壓力將大大減小。這也促進了兩步法層析工藝替代三步法層析工藝，從而簡化下遊工藝流程。兩步法層析工藝包含protein A親和捕獲及多模式強陰離子capto adhere精純兩步。Capto adhere可以提供電荷作用、疏水相互作用及氫鍵等多種作用力模式，可以同時結合多種雜質（核酸、HCP、內毒素及病毒等）。兩步法抗體純化工藝不僅大大縮短了整個下遊工藝開發的時間，提高了整體收率，同時可以節約填料、溶液等耗材成本及層析系統及層析柱等硬體投入。

MabSelect系列的親和填料和Capto adhere複合模式填料組成的兩步法層析純化工藝（見圖Fig1右）。純化效果見Table1，經過Protein A 親和捕獲後的樣品經過低pH滅活、深層過濾後，通過Capto adhere進行精純。常見的工藝相關雜質（HCP,DNA, Protein A、病毒等）以及產品相關雜質均達到理想的去除效果。

基於對研發的一貫嚴謹性，為了平衡收率和雜質去除效果，可以通過DOE進行工藝優化（見圖Fig2）。結果表明：load pH越高，電導越低，雜質去除效果越好；載量越低，雜質去除效果越好，但收率越低。

弱結合的陰離子層析（Weak Partitioning Chromatography, WCP）

傳統的陰離子層析是流穿模式，目標抗體流穿，雜質被吸附在層析柱上，以此來達到雜質去除的目的。而弱結合的陰離子層析是介於結合洗脫（Bind/Elute）和流穿模式（Flowthough）之間（見Fig4）的一種層析方式，通過調節樣品的pH、電導等參數，使部分目標蛋白同時也結合到層析柱上。在此條件下，雜質的結合能力更強，對雜質的去除效果也越好。結合的目標蛋白可以通過後面的淋洗過程回收，當然，也可以通過提高上樣量來提高回收率。

採用WPC mode，雜質去除效果非常好，較難去除的聚集體可以從18%降到<2% (見Fig 5).

連續流技術（periodic counter current，PCC)是採用多根層析柱，在純化過程中，這幾個柱子在上樣、淋洗、洗脫、再生之間交替進行的一種純化形式。一般第一個柱子會過載，飽和的料液會流到下一個柱子上，這樣充分利用填料的載量（見Fig6），詳細流程圖見Fig 7。

柱1已達到確定的載量上限，柱2成為上樣的第一個柱子，柱3變為上樣的第二個柱子，柱1進入淋洗、洗脫、再生、CIP、再平衡。

柱2載量達到飽和，進入淋洗、洗脫、再生、CIP、再平衡，柱3開始上樣。在步驟3中，柱1現在已經準備好進入下一個循環，準備開始上樣。此過程以循環方式重複，以實現連續操作。


PCC技術三個優勢：

① 減少填料的使用量，降低填料成本（見Table 2）；

② 減少buffer的消耗；

③ 縮短工藝時間。

在下遊純化過程中，與傳統批次生產相比，產品的質量一致，見Table 3。

超速單批次使用纖維層析技術-Fibro PrismA

Fibro PrismA，纖維素全新基質+強耐鹼PrismA配基，處理通量激增，可是將保留時間從原來的min提速到s，但仍可保持~30 g/L的動態結合載量，使得整個親和層析的時長從原來的5小時縮短到5分鐘以內，生產效率相較之下可以實現20倍以上的提高。


同時，Fibro PrismA能夠耐受2M NaOH，實現更為高效的清洗，有效控制內毒素與微生物。適用於細胞株的快速篩選及下遊純化工藝開發等實驗樣品數量多、實驗通量要求高的階段，大大降低臨床早期樣品製備的成本，提高商業化生產的靈活性。

圖8. Fibro PrismA將工藝周期從傳統的5小時縮短為3~5分鐘附圖2：用於工藝開發的兩款Fibro PrimsA

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《抗體藥物工藝優化應用文獻》




1) Eriksson K, Ljunglöf A, Rodrigo G, et al. MAb contaminant removal with a multimodal anion exchanCytivar[J]. BioProcess International, 2009.2) D. Kelley B, Tobler S A, Brown P, et al. Weak partitioning chromatography for anion exchanCytiva purification of monoclonal antibodies[J]. Biotechnology and bioengineering, 2008, 101(3): 553-566.3) Linda Mathiasson, Linda Persson, Mikael Berg, Scalable continuous chromatography process for enhanced efficiency in biomanufacturing4) Continuous chromatography in downstream processing of a monoclonal antibody. CYTIVA webs

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