核酸提取與純化時應該了解的事兒

一、核酸提取與純化介紹

核酸提取是分子生物學的基本組成部分，因高質量的核酸是分子生物學上的應用至關重要。

我們將會總結一些現用核酸提取技術和針對樣品類型選擇正確提取方法的小建議；也會提及評估核酸濃度和質量，以及核酸提取過程中的常見問題。

a. 為什麼需要核酸提取？

核酸提取為大量廣泛研究和應用提供了答案（例如：克隆、qRT-PCR和全基因組、轉錄組範疇中的二代測序技術），獲得的核酸可以多種方式進行應用。

準確的研究目的，決定了要提取的核酸類型；核酸的應用往往影響提取方法的選擇。（例如：標準的End-point PCR反應，不需要與全基因組測序實驗相同的DNA質量）

為了確定最佳的研究方法，有必要清楚了解核酸的下遊應用以及任何與樣品類型相關的潛在限制。（例如，臨床樣品採集量往往有限，核酸提取存在挑戰。）  

雖然依據樣品類型，細胞裂解方式不同，但整體的核酸提取核心原則不變：細胞或組織樣品裂解，去除非核酸汙染物（例如，蛋白質等）。

提取核酸的原因：

①為了分析基礎研究和疾病研究中的基因表達； 

②跟蹤對藥物治療的反應（例如，在抗病毒治療期間和之後監測病毒滴度）。

③識別新物種並深入了解進化過程（例如，Ancient DNA分析）。 

④對人類、動物和植物中引起傳染病暴發的病原體進行監測和分類。 

⑤通過微生物檢測和量化監測食品和水安全。 

⑥診斷疾病（如基因疾病，癌症，免疫學缺陷）。

b. 細胞裂解的方法

細胞裂解在很大程度上取決於樣品類型，更堅固的組織，如植物，與哺乳動物相比則需要更大的力量進行處理。 

細胞裂解方法分為三大類：機械裂解、酶裂解和化學裂解。  

這個三種分析方法的基本原理和每種方法的優缺點如下：

方法一：機械裂解

機械裂解：細胞膜被外力破壞。 

優勢： 

效率高，速度快；  

快速裂解縮短了從採集樣本到分離核酸的時間，這在基因表達分析實驗中可能是至關重要的；

非常適合於難以溶解的樣品（例如，植物材料，絲狀真菌和酵母）。 

劣勢： 

根據使用的方法，多樣本處理時比較耗時（例如，人工手動研磨處理）；

大量樣品處理耗時，可能會增加樣品降解的風險；

機械處理會在樣本中產生熱量，導致蛋白質聚集和核酸降解；l需要一些特殊工具或儀器。

方法二：酶裂解

添加一種酶來消化蛋白質或細胞結構，如酵母細胞壁和絲狀真菌。 

優勢：

實驗室中的理想方法，過程中無需機械裂解設備； 

選擇性的去除細胞壁，留下細胞部分採用另一種裂解方式（通常是化學裂解），方法靈活，避免了一些由機械裂解產生的破壞。 

劣勢： 

耗時（酶消化可能需要1小時）而且價格昂貴；  

由於酶誘導的細胞變化可能影響基因表達，因此不適合進行基因表達分析。

方法三：化學裂解

在化學分解過程中，細胞被一種能分解脂膜的洗滌劑清洗，從而釋放細胞成分。除洗滌劑外，化學裂解緩衝液通常含有離液鹽，如鹽酸胍或尿素，這有助於破壞降解新暴露核酸蛋白質（如核酸酶）的穩定性，並使核酸與二氧化矽基質結合。化學裂解緩衝液的確切組成取決於應用方向和樣品類型。 

優勢： 

價格便宜，操作簡單，速度快；無需專用設備。 

劣勢：  

破壞細胞膜的洗滌劑通常也會溶解其他細胞膜，從而釋放其成分。這種方法不適於細胞器特異性核酸的提取；

雖然這項技術對大腸桿菌有效，但對革蘭氏陽性細菌、植物細胞或真菌細胞無效，因為存在阻止洗滌劑進入細胞膜的硬細胞壁；  

在大腸桿菌樣品中同時加入洗滌劑和離液鹽可能會影響質粒DNA和基因組DNA的區別能力。但是，可以採取步驟區分這些類型，稍後討論。 

化學物質會給研究人員帶來危險。

c. 核酸純化原理的理解

在細胞裂解後，核酸被選擇性的從周圍細胞成分中釋放出來，集中在水溶液或合適的緩衝溶液中以供下有使用。細胞理解後的步驟，統稱為純化。由於分離的核酸化學性質不變，無論樣品類型如下，下面描述的純化策略通常適用於所有樣品類型。

①離心柱（Spin Columns）

該方法通常跟試劑盒緊密相關，離心柱提取和純化可以快速獲得高質量DNA、質粒、RNA和PCR產物，而無需進行新鮮試劑製備。離心柱含有矽膠或專有樹脂的固體基質，用於選擇性結合核酸。

典型離心柱提取操作步驟：

A.裂解的樣本保留至離心柱：

裂解後的樣品，收集在含有離液鹽的結合緩衝液中，置於旋轉柱。結合緩衝液允許核酸與水溶液分離並與柱基質結合。

B.核酸的結合：

離心使整個樣品與柱基質接觸。樣本中的核酸選擇性地與柱結合，而其他細胞組件通過（這通常稱為流過）柱基質。

C.洗滌：

結合後，對柱子進行清洗，以去除可能嚴重影響下遊應用的任何殘留汙染物，如蛋白質或殘留鹽類。清洗次數取決於試劑盒。一些洗滌緩衝液中含有離液鹽以去除蛋白質，有些緩衝液中含有高濃度的乙醇以去除鹽類。大多數試劑盒都幾乎全部包括由乙醇組成的緩衝液作為最後清洗步驟，以確保完全除鹽。

D.離心柱殘留乙醇的去除：

清洗後，有時會進行短時間的空離心以去除殘留乙醇。

E.洗脫：

從基質中洗脫核酸，加入少量的水或洗脫緩衝液*，柱子靜置幾分鐘。自上一步，離液鹽已經被去除，洗脫緩衝液能夠使核酸再水化，使核酸與柱基質分離。最後一次離心可以將含有核酸樣品的水溶液轉移到新的離心管中。

*核酸通常儲存在含有Tris和EDTA（TE緩衝液）的緩衝液中。EDTA的存在有助於抑制核酸酶活性。雖然TE緩衝液對抑制核酸酶是有效的，TE中EDTA的含量通常比大多數的Mg2+含量低幾個數量級。

離心柱的優劣勢：

優勢： 

低成本 

高效可靠 

產生核酸適用於用於下遊應用 

劣勢： 

生長緩慢的菌株核酸量低 

洗脫不完全導致核酸流失 

離心柱的結合能力決定了核酸的總量

質粒離心柱試劑盒

質粒提取試劑盒可以從大腸桿菌中快速分離質粒，是分子生物學實驗室中應用最廣泛的試劑盒之一。

由於大腸桿菌易於化學裂解，質粒試劑盒將樣品裂解和核酸純化結合如下： 

A.在細胞碎片被離心沉澱之前，細菌細胞在離心管中裂解； 

B.裂解液的配置使得只有質粒DNA在裂解後可以跟離心柱結合。因此，細胞裂解液通過離心可以立即掛載到柱上。 

C.將含有裂解物的質粒與離心柱結合，剩餘的純化步驟與所有其他離心柱方案相似。 

D.水或TE緩衝液中洗脫使用高質量質粒DNA。

**大多數離心柱試劑盒在裂解過程中將質粒DNA與基因組DNA（gDNA）進行區分。裂解緩衝液中含有氫氧化鈉和十二烷基硫酸鈉，使質粒和gDNA完全變性。接下來的步驟，中和了樣本，使質粒DNA重獲新生。然而，高分子量的gDNA不能完全重新結合，並且容易與樣品中的蛋白質纏結，從而阻止gDNA與離心柱結合，從而導致其去除。儘管在效率和可靠性上，質粒離心柱試劑盒存在一些缺點。試劑盒的優化標準主要是通過大腸桿菌菌株，生長緩慢或不穩定的菌株可能會發生低產量。此外，質粒試劑盒和離心柱試劑盒的結合能力有限，根據試劑盒的不同，總回收率在50到100μg之間。

其他離心柱試劑盒

除核酸提取外，離心柱還用於核酸的純化和濃縮。純化試劑盒，可用於移除PCR或其他酶製劑反應中未被發生反應的殘留試劑，並從瓊脂糖凝膠中純化DNA。濃縮樣品可以為許多下遊應用提供更大的靈活性。  

一些商業離心柱試劑盒具有片段篩選的功能，允許根據研究目的選擇合適的篩選片段範圍試劑盒（例如，小RNA）。這是通過改變緩衝溶液中的乙醇含量來實現的。  

許多離心柱試劑盒結合了細胞裂解和核酸純化，我們便可從幾乎任何類型的樣本中找到分離核酸的離心柱，包括但不限於昆蟲、植物、種子、真菌、細菌、唾液、血液、糞便和石蠟包埋樣品。

② 苯酚/氯仿和乙醇沉澱

苯酚/氯仿提取法是一種依靠溶解度不同原理分離核酸的方法。樣品暴露於給定比例苯酚/氯仿混合液中獲取所需的核酸。蛋白質可溶與苯酚/氯仿，核酸可溶於水。當苯酚/氯仿溶液與樣品混合時，蛋白質和核酸被分離，為純化提供保障。

對於RNA和DNA的雙重提取，此過程可通過添加酸性苯酚進行調整。這使得過量的H+離子與磷酸鹽骨架相互作用，導致DNA不帶電。DNA將溶解在酚/氯仿萃取的酚層中，而RNA由於其天然的酸性，將保持溶解在水相中。離心後可以分離水相和有機相，並且每相都可以進行乙醇沉澱。

經典苯酚/氯仿和乙醇沉澱的操作步驟：

A.苯酚和氯仿的接觸：

裂解的樣品與苯酚/氯仿通常通過強旋渦混合。旋渦確保所有有機成分都能與苯酚/氯仿混合物充分相互作用，以達到完全溶解和去除的目的。

B.離心：A步驟後，可見兩個相。含有核酸的水相位於頂部，而底部的有機相含有蛋白質、脂質和其他大分子。然後離心樣品以完全分離這兩個相

C.相分離：用移液管小心地除去水相。 

D.乙醇沉澱：用乙醇沉澱、純化核酸。在乙醇沉澱過程中，加入鹽和乙醇以緩衝水溶液中的核酸。鹽緩衝糖磷酸骨架，乙醇改變溶液的介電常數。這使得核酸能夠從水溶液中分離出來，從而可以通過高速離心分離。

E.重懸：在水或TE緩衝液中重新溶解成團的DNA或RNA。

苯酚/氯仿提取的優、劣勢：

優勢： 

效率高，通常比離心柱的產量高；ü適用於提取完整的高分子量DNA（如，gDNA）；  

懸浮在複雜溶液中的樣品通常仍適用於該方法，而一些揮發性化合物可幹擾離心柱柱基質；

對於脂肪類型樣品（如，腦組織），苯酚/氯仿提取優於大多數離心柱試劑盒。

劣勢：

如果處理不當，苯酚和氯仿是有害的，必須在通風櫃中極其小心地進行處理。  

這種方法比離心柱試劑盒要費時，而且可能導致較低的得率。  

核酸提取物中含有微量的苯酚和氯仿會對下遊的酶反應產生負面影響，如，PCR。如果是這種情況，則需要在PCR之前清除。因此，有許多離心柱純化試劑盒。  

要有把握地提取不含汙染物的水相，可能需要一點實踐經驗。

③提高通量的自動化方法

根據核酸的應用和樣本類型的不同，可選擇適合的高通量提取方法。最常用的是磁珠提取。在這項技術中，正電荷磁珠被引入到樣品中，DNA在低pH下與帶正電荷的磁珠結合，在高pH下釋放DNA。珠子可以通過磁鐵去除，溶液的pH可以很容易的調節，以分離所需核酸。這項技術快速高效，但在自動化設備上的投資可能會相當昂貴。（磁珠的包被材料不同，原理略有差異。）

d. 關鍵因子及對提取的影響

在進行核酸提取或純化時，必須密切注意一些因素，如pH值、鹽濃度、溫度、緩衝體積和潛在的乙醇汙染。這些因素中的每一個都會極大地影響下遊實驗的得率、質量和成功率。

1.非最適pH值或鹽濃度可改變核酸的電荷，導致核酸不能與離心柱結合，或導致苯酚/氯仿錯誤的溶解核酸。 

2.緩衝液體積不正確，可導致不完全裂解，中和或間接稀釋洗脫的核酸。 

3.乙醇汙染可以抑制下遊的酶反應，並使樣品從瓊脂糖凝膠中飄浮出來。

e. 特殊情況

1.高分子質量DNA的提取

對於某些應用（如，Southern雜交和一些測序過程），提取完整的高分子量（HMW）DNA是必要的。要提取HMWDNA，除了上述因素外，還需要考慮其他因素：

HMW-DNA在提取過程中容易斷裂。因為剪切力（渦流、超聲波等）可導致DNA分子的分解，從而在提取後產生較短的片段。為了避免這一點，對樣本施加最小的剪切力。

對於需要對HMWDNA進行可視化的應用，可以在瓊脂糖凝膠塞中進行裂解和提取，從而在整個過程中穩定DNA（例如，脈衝場凝膠電泳），其中整個染色體保持完整，並通過電泳顯現。

鹼裂解常常導致HMW-DNA的丟失，因為在變性過程中，HMW-DNA會發生不可逆的纏結。

如果使用離心柱提取HMW-DNA，考慮柱基質的結合容量大小。一些色譜柱只能處理10-15kb大小的片段，因為由於緊密結合，較大片段很難從色譜柱中洗脫。對於較大的碎片，可能需要考慮高HMW結合的專用柱，或手動方法，如苯酚/氯仿提取和乙醇沉澱。

2.SmallRNAs 

在傳統的RNA提取過程中，小RNA分子經常丟失，因為傳統的離心柱通常有大約100個鹼基對的尺寸限制，儘管尺寸限制值很大程度上取決於緩衝液的配方。小RNA分子對於理解生物功能極其重要，所以大多數總RNA提取純化試劑盒都經過優化以捕獲這些小RNA。

二、評估提取的核酸

a. 定量與質控

在核酸提取和純化之後，了解提取樣品的濃度和質量是非常重要的。根據下遊實驗目的的不同，這些參數的波動會極大地改變結果。例如，如果每個cDNA合成反應不使用完全相同的總RNA，qRT-PCR的表達分析將導致不可靠的數據。有許多核酸評估方法，它們在時間消耗、成本和精度上有所不同。最終，選擇方法時應考慮下遊實驗的要求。

以下是一些最常見的評估方法的概述：

1. 瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳以分子量為基礎，通過在電流的存在下通過固化的凝膠基質將核酸分離出來。將提取的核酸與平行的分子量標準進行比較，所述分子量標準包含已知大小和濃度的片段。

優勢：目測DNA質量；完整的基因組DNA樣本顯示為完整條帶；降解的核酸顯示為彌散狀態；核糖體RNA清晰可見；可供大多數實驗室使用；可視化可能存在的汙染（例如，質粒純化樣品中存在RNA）。

劣勢：只提供粗略的濃度估計；不顯示樣品中存在汙染物，如鹽。

2. 毛細管電泳

毛細管電泳，有時被稱為晶片上的實驗室，通過一個由檢測器監測的小毛細管來吸取樣品，計算機接收信息並以圖形方式顯示。毛細管電泳適用於分析片段大小、數量和樣品的整體質量。這種技術比傳統的瓊脂糖電泳更精確，通常是在qPCR之前進行核酸評估的方法。

優勢：多類型核酸的精確分析；自動上樣和定量比凝膠法更精確；高靈敏度-可檢測和分析少、微量樣品。

劣勢：價格昂貴。

3. 分光光度法

分光光度法是一種快速檢測技術，它依賴於光與樣品相互作用的特性來精確定量。樣品被裝入通過測試的儀器（分光光度計）中不同波長的光通過它們，然後被探測器接收。探測器提供有關樣品數量和質量的信息，然後計算機軟體翻譯。通過在260nm和280nm處測量吸光度，兩者的比值表示樣品的純度。對於純DNA和RNA，260/280的比率應該在1.8到2.1之間。可在230nm處進行額外測量，低於2.0的230/280nm比率表示存在有機汙染物。

近年來，一種新型的基於螢光的分光光度分析方法在分子生物學實驗室得到了廣泛的應用。這種基於螢光的技術比傳統的分光光度法具有更高的靈敏度，並且能夠通過使用DNA和RNA特有的螢光染料來區分DNA和RNA。

優勢：準確快速；提供關於汙染物存在的信息；大多數實驗室都有分光光度計。

劣勢：無法量化單個片段；昂貴。

b.提高核酸質量

儘管我們盡了最大的努力，但通常還是有必要採取額外的措施來提高核酸質量。以下將描述在需要改進核酸質量時需要考慮的一些附加因素。

1.使用和儲存溫度：

核酸易被核酸酶（即RNase和DNase）降解，低溫儲存有助於抑制酶活性。DNA天生比RNA更穩定，在較高的儲存溫度下對核酸酶活性更具抵抗力。

DNA應儲存在-20℃或以下，並在使用過程中保存在冰上。反覆的凍融可能會使DNA片段化，特別是HMW-DNA。因此，如果經常使用HMWDNA，則應將其儲存在4℃下。

RNA更易被核酸酶降解，應始終保存在非常低的溫度（-20至-80℃），只有在絕對必要時才能解凍。

2. 核酸酶抑制劑和清洗液

核酸酶的存在可以快速降解核酸樣品。很容易將核酸酶從未受保護的手轉移到工作表面；因此，在使用核酸時應始終戴手套。

工作場所應保持清潔，並經常用乙醇擦拭，以去除核酸酶汙染。有許多商用產品可以防止RNase汙染。許多研究人員還將核糖核酸酶抑制劑焦碳酸二乙酯（DEPC）添加到水中，用於RNA的工作。在RNA工作之前用EDPC清洗和處理玻璃器皿也是可取的。

近年來，市場上出現了許多核酸穩定劑。與上述清洗溶液不同，這些試劑在採集點直接添加到完整樣品中，以抑制核酸酶並穩定核酸，直到進行提取。儘管這些試劑中的大多數與大多數下遊提取試劑盒和應用兼容，但其中一些試劑需要在提取核酸之前從完整樣品中去除。

3. 使用無核酸酶耗材

使用任何核酸時，確保對任何消耗品或玻璃器皿進行核酸酶處理。儘可能購買無核酸酶管和帶過濾器的吸管頭。如果在分析之後，您發現您的DNA產量很低，質量不理想，或者如果提取的DNA通過了您的質量評估，但您在下遊實驗過程中獲得了不理想的結果，則需要進行一些故障排除。