質粒DNA的提取與純化

2021-01-11 生物谷
質粒DNA的提取與純化

來源：來源網絡 2007-04-02 16:28

一、實驗目的與原理
質粒多為一些雙鏈、環狀的DNA分子，是獨立於細菌染色體之外進行複製和遺傳的輔助性遺傳單位。質粒是進行分子生物學實驗操作，進行遺傳工程改良物種等工作時最主要的DNA載體。提取質粒的基本步驟分為三步：①細菌的培養和質粒的擴增，②細菌菌體的裂解，③質粒DNA的純化。本實驗採取的菌體裂解方法為鹼解法，質粒純化方法為梯度離心法。
二、材料與試劑
1、材料：大腸桿菌
2、儀器：超淨工作檯，培養箱，搖床，恆溫水浴鍋，臺式離心機，取液器一套，低溫冰箱，冷凍真空乾燥機，電泳儀，水平電泳槽，紫外觀測儀
3、試劑：
Solution I 25 mM Tris-Hcl(pH7.4)
10 mM EDTA(pH8.0)
50 mM葡萄糖
高壓滅菌，4℃保存
Solution II 0.2 M NaOH, 1%SDS 現配現用
Solution III 5 N KAc pH4.8
高壓滅菌，4℃保存
3 M NaAc PH5.2, 高壓滅菌，4℃保存。異丙醇，溶菌酶（8 mg/ml），酚/氯仿，無水乙醇，70％乙醇，LB培養基，電泳試劑
三、操作步驟
1、細菌繁殖
LB培養基，2 ml/20ml，37℃，200rpm，搖一搖，過夜
2、離心10 min，5000 rpm, 4℃；棄上淸液
3、沉澱（菌體細胞）預冷的TES緩衝液洗滌，離心10 min，5000 rpm, 4℃
加入預冷的1 ml Solution I，冰浴，10 min
4、重新懸浮，加入150 ul溶菌酶母液，室溫放置5 min
5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴，5 min
6、加入0.9 ml預冷乙酸鉀，混勻，離心10 min，12000 rpm, 4℃
7、加入1.5 ml異丙醇，-20℃冰箱內放置15 min
8、離心10 min，12000 rpm, 4℃
9、取沉澱，懸於400 ul TE緩衝液中
10、加入40 ul，3 M NaAc
11、酚/氯仿，抽提，乙醇沉澱
12、離心10 min，12000 rpm, 4℃
13、取沉澱，冷凍乾燥，再懸浮於50 ul TE緩衝液中。
14、電泳檢測提取DNA的質量
三、結果與分析
超螺旋結構DNA

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