新手入門:質粒的轉化,滿滿乾貨|細胞|培養液|培養基|dna_網易訂閱

2021-01-09 網易

　　原理：在受體細胞經過化學試劑或者電擊處理等方法處理後，受體細胞的膜通透性發生改變，質粒DNA或者以其為載體的重組DNA分子，進入到細菌體內而實現擴增。

　　感受態細胞：是指細胞自然或者經過誘導處於容易吸收外源DNA的一種生理狀態。在基因工程中，用於轉化的受體菌（Restriction-Modification 缺陷變異株，以防止對導入外源DNA進行切割）一般通過誘導的方式實現。主要原理就是通過處理使細胞的通透性變大，直觀的說，使得細胞膜表面出現一些孔洞，便於外源基因或載體進入感受態細胞。由於細胞膜的流動性，這種孔洞會被細胞自身所修復。

　　

　　質粒的轉化主要包含

　　Ⅰ感受態細胞製備

　　Ⅱ質粒DNA轉化

　　Ⅲ質粒DNA的提取

　　（Ⅰ）感受態細胞製備

　　1）從新活化的大腸桿菌（常用DH5a）平板上挑取一個單菌落，接種於3ml LB培養基的試管中，37℃振蕩培養過夜。

　　

　　

　　2）將該菌懸液按照1:100轉接到液體培養基中，100ml，37℃振蕩擴大培養，2~3h。當培養液開始渾濁時，間段性測試OD600，在數值為0.3-0.5時停止培養。

　　

　　3）培養好的菌液轉移到離心管中，冰上放置20min，0℃-4℃離心10min（4000r/min）。

　　

　　

　　4）棄掉上清，管口倒置以便培養液棄除乾淨。

　　5）加入0.1mol/L冰冷的氯化鈣溶液30ml，小心懸浮沉澱細胞，冰浴30min。（氯化鈣的濃度和純度非常重要，不同批次不同廠家的產品均可影響感受態轉化率）

　　

　　6）4℃離心10min（4000r/min）。

　　

　　7）棄掉上清，用0.1mol/L氯化鈣2ml冰浴懸浮細胞（冰上放置）片刻，感受態細胞製成。

　　8）可直接用於實驗，4℃保存。也可分裝長期保存，加入總體積15%的滅菌甘油，-70℃條件下保存。

　　

　　（Ⅱ）質粒DNA的轉化

　　1）取100ul新鮮製備的感受態細胞，加入質粒1ul DNA混勻,同時設置對照組（未加質粒，未加受體菌，已知具有轉化活性的DNA）。

　　冷凍的感受態細胞要在冰上解凍，待管中最後一點冰融化後，迅即加入DNA. 解凍感受態細胞溫度高於0℃，會降低轉化效率。

　　

　　2）冰浴30min，離心管放到42℃保溫90s（不要搖動離心管）。冰浴時間短於30min ,可能影響轉化率。然後迅速冰浴2min。

　　

　　

　　3）向離心管加800ulLB液體培養基，37℃振蕩培養1h（150r/min）。37℃生長1小時能夠對於細胞恢復和抗生素抗藥性表達具有最佳效果。

　　

　　

　　4）取適當（50ul）的復甦細胞培養液，塗布在含抗性的選擇性培養基上，將培養皿放置在37℃恆溫培養箱中，正置30min。等菌液完全被培養基吸收後，倒置培養皿，在37℃恆溫培養箱中，培養12~16h，出現菌落。

　　

　　

　　

　　5）菌落結果：

　　

　　① 無菌落

　　失敗或者培養條件不充分

　　

　　② 布滿菌落,

　　呈苔樣，失敗。可能是抗生素濃度不夠或失敗。出現大菌斑，大多是由於黴菌汙染所致

　　

　　③ 布滿菌落

　　濃度太高，失敗

　　

　　④ 出現菌落

　　符合要求

　　Ⅲ）質粒DNA的提取

　　質粒DNA的提取，由於其本身分子量小，一般採用鹼裂解法提取。目前已研發出多種質粒提取試劑盒，實驗操作簡單，只需按照產品操作說明操作即可。不過對於其中主要試劑和作用的理解，能夠避免實驗過程中的一些問題，或者能夠更好的解決問題。

　　各廠家提供的試劑盒中試劑不盡相同，一般的提取純化試劑盒，主要包括以下試劑：

　　A. 細胞懸浮試劑: 主要作用是將菌體細胞懸浮起來。菌體懸浮不完全會導致裂解不完全，質粒的提取純度和得率都會下降。通常需要在裡面加入RNA酶（RNase A），RNA酶的作用很清楚，降解掉溶液中的RNA。通常選用Tris-HCl作為體系中pH穩定緩衝液。EDTA，金屬離子螯合劑可以和細菌體內的金屬離子結合而DNase的活性受到抑制。有的會有葡萄糖，可用來增加溶液粘度，保證菌體懸浮，延緩菌體沉澱時間。

　　B. 細胞裂解試劑：主要作用是裂解細胞，通過鹼溶液的作用破壞細胞膜結構，使其雙層膜結構改變，而導致細胞裂解。一般由一定濃度的NaOH和SDS組成。SDS的作用與後期中和過程中清除掉蛋白質等細胞雜質有關係。此步驟中需要注意的是，鹼溶液的作用時間不能太長，也不可劇烈離心管，反之會導致鹼破壞基因組DNA，導致同等大小的基因組DNA被提純，造成汙染。

　　C. 中和試劑：主要作用使中和掉細胞裂解試劑中的鹼性物質，並去除掉其中的蛋白等雜質物質。組份有醋酸鉀和醋酸，或者乙酸鉀和冰乙酸。

　　D. 清洗Buffer: 主要是清洗掉多餘的鹽離子。DNA被試劑盒中的提取柱吸附之後，需要用wash buffer 洗脫掉多餘的鹽離子。主要成分有Tris-HCl和乙醇。需要注意的使乙醇對後續酶切和測序反應會有影響，因此在後續洗脫DNA前，必須完全清除柱子中的乙醇。

　　E. 洗脫Buffer: 主要作用就是洗脫矽膠柱上的DNA樣品。

　　1.柱平衡：在柱中加入2ml的平衡buffer，通過重力的作用，使平衡buffer都流出。

　　2.細胞收穫：對於高拷貝質粒（培養液中，>2g DNA/mL)，吸取1-3ml培養液,離心去上清；對於低拷貝質粒（培養液中，<2g DNA/mL)，吸取10-15ml培養液，離心去上清。

　　3. 細胞懸浮：加0.4mL的細胞懸浮液(containing RNase A)懸浮細胞，並使其混勻。

　　4. 細胞裂解：加入0.4mL細胞裂解液，通過上下顛倒帶蓋子管子5次使其輕輕混勻，不要渦旋，之後在室溫下放置5min.

　　5. 中和：加入0.4mL的中和試劑，立即混合均勻。當大的細胞顆粒被處理後，可能會進行更劇烈的搖動。但是，不要渦旋！~12,000xg離心混合物10min. 如果是採用的4°離心，上清液需要恢復到室溫，再加入到柱子中。

　　6. 裝柱：吸取步驟5中的上清液到平衡柱中。讓混合液通過重力的作用流出，棄掉流出液。

　　7. 柱子清洗：2.5 mL的Wash Buffer洗脫柱子量次。每次清洗讓清洗液通過重力的作用流出，棄掉流出液

　　8. 質粒DNA洗脫：加入0.9mL的Elution Buffer。讓Elution Buffer通過重力的作用流出。不要強行弄出裡面的液體。

　　9. 質粒DNA沉澱：加入0.63mL異丙醇去析出，混勻，~12,000xg at/4°C離心30min。小心的去掉上清，之後風乾10分鐘

　　10. DNA純化：將管子中的DNA溶解到TE buffer中。將這些溶液轉移到新管中。

　　重組質粒鑑定的方法：

　　① 雙酶切後跑電泳；直接DNA電泳可判斷整個DNA重組質粒是否正確。② PCR(插入片段在2kb以下時)，然後電泳。

　　③ 送公司測序（最為準確的鑑定方式）。

　　影響轉化效率的因素：

　　① 細胞狀態和細胞密度: 培養菌最好選用傳代次數少，且保存於-70℃或者-20℃。不要使用經過多次轉接或者保存於4℃環境中培養菌。細胞生長密度以剛進入對數其為最好，可通過檢測培養液的OD600值來判斷，密度過高或者不足，都會影響轉化效率。通常DH5α菌株在OD600的值為0.5左右，細胞密度在5*107個/ml左右比較合適。密度過高或者不足均會影響轉化效率。

　　② 質粒的質量和濃度：轉化的質粒DNA中，超螺旋狀態的質粒，轉化效率最好。在一定濃度範圍內，轉化的效率與添加質粒的濃度成正比。不過在添加的質粒的量和體積過大的時候，轉化效率也會降低。質粒的分子量越大，通常來說轉化率也會降低。

　　③試劑的質量：轉化過程中所用的試劑，如氯化鈣的濃度和純度非常重要，不同批次不同廠家的產品均可影響感受態轉化率。

　　④防止雜菌和DNA汙染：實驗需要在無菌條件下進行，所用的儀器和試劑均需要滅菌處理，並防止在實驗過程中引入其他汙染。

　　⑤培養過程的條件：培養瓶中培養基的量關乎到菌體生長過程中的能量代謝。通常來說厭氧環境做出來的感受態的轉化效率較低。建議500ml三角瓶液體培養基量不超過100ml, 250ml三角瓶液體培養基量不超過50ml. 培養基的pH值要適宜，接種前一般pH值在6.8-7.2，等培養結束後可以再測一下pH值最好在6.5以上（不低於6.0），表示菌體的代謝為有氧代謝，生長狀態良好。培養基中的各種離子和溫度，也對形成好的感受態有關係。

　　幾種擴增常用感受態細胞：

　　① 普通骨架載體cDNA產品

　　DH5α：常用於質粒克隆，可用於藍白斑篩選

　　TOP10：適用於高效的DNA克隆和質粒擴增，能夠保證高拷貝質粒的穩定遺傳。

　　TG1: 生長速度快，常用於噬菌體的製備，同時也可用於普通質粒的構建。

　　CopyCutter：適用於有毒克隆。

　　② 慢病毒載體質粒：

　　Stbl3: 是慢病毒載體系統推薦使用的菌株，可有效抑制長片段末端重複區的重組，降低錯誤重組的概率

　　Stable（NEB）：可用於逆轉錄病毒/慢病毒載體系統擴增。

　　本文轉至：傲銳東源

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