重組DNA轉化實驗原理:
帶有外源DNA的重組體分子在體外構建成後,需要導入適當的宿主細胞內進行繁殖或表達出具有一定生物活性的蛋白。能夠作為重組體轉化的受體,主要有動物細胞、植物細胞、微生物細胞等。導入受體細胞的途徑重要有轉化(轉染),顯微注射和電穿孔等多種不同的方式。可以根據不同的受體選擇不同的導入方式。一般情況下,細菌一類的原核生物和酵母這樣的低等真核細胞可用轉化方式導入,而高等動植物細胞則需採用顯微注射或電穿孔來進行。
細菌表面通過CaCl2處理後,局部失去細胞壁或細胞壁溶解,DNA分子能夠通過質膜進入細胞。其進入細胞的方式是完整的雙鏈DNA分子首先吸附到細胞表面,雙鏈DNA分子解鏈變成單鏈,單鏈DNA分子一條進入受體細胞內,另一條被降解。進入細胞內的單鏈DNA則複製成雙鏈環狀DNA,隨同複製子同時複製,並被轉錄翻譯。
實驗方法(用CaCl2製備新鮮的感受態細胞轉化法):
感受態細菌製備
(1) 挑取在平板上活化的菌落接種於2毫升LB培養液中,在370C培養過夜。
(2) 按1%挑取過夜培養菌接種於50mlLB培養液中,370C振蕩培養2~2個半期小時(OD600約在0.2~ 0.4) 。
(3) 培養物放冰浴中冷卻10分鐘。
(4) 分裝離心管中,40C5000rpm離心5min,收集菌體,培養液儘量倒乾淨。
(5) 把菌體懸浮於10 ml的100mmol/L CaCl2 溶液,置冰浴中20min,40C5000rpm離心5min,收集菌體。
(6) 再將菌體懸浮於1-2ml的100mmol/L CaCl2 溶液中,40C保存,12-24小時後即可作為感受態細胞進行轉化。
轉化實驗
(7) 取200ml感受態菌,加入待轉化的重組DNA(體積應小於10ml,DNA<50 ng)混勻後置冰浴中30min(一般同時要做陽性對照和陰性對照。陽性對照為加入已知量的未重組質粒DNA的感受態菌,用於檢測轉化效率。陰性對照為完全不加質粒DNA的的感受態菌,用於檢測感受態細菌有無汙染及檢測抗生素的活性)。
(8) 放入冰浴中30 min,轉入420C水浴90s,再冰浴1-2 min,加入培養液800ml,放370C振蕩培養45min。
(9) 將適當體積已轉化的感受態細胞均勻鋪於平皿上。
(10)待平皿中液體吸收後,倒置平皿,於370C培養12-16小時可出現菌落。
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