還記的一個月前有朋友後臺問能不能寫一篇關於同源重組敲除基因的技術，由於不習慣查看後臺消息所以沒有第一時間回復。接下來就是同源重組技術了。本來是想由我的三位萌新師弟寫，我負責匯總。收上來後發現不是那麼回事兒。在此公開點名一下我們的豹豹童鞋，作為小組稻瘟菌研究的唯一男孩子（不包括畢業生哈）。想著ATMT是他現階段主要用到的實驗步驟，沒想到收上來的竟然是copy的，還是植物。。。只能我依靠記憶寫了（大神勿噴）。
首先拆詞講一下這兩個關鍵詞的意思：
1、同源重組（Homologous Recombination) 是指發生在非姐妹染色單體（sisterchromatid) 之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內的重新組合。
2、基因敲除（knockout）是用含有一定已知序列的DNA片段與受體細胞基因組中序列相同或相近的基因發生同源重組,整合至受體細胞基因組中並得到表達的一種外源DNA導入技術。它是針對某個序列已知但功能未知的序列，改變生物的遺傳基因，令特定的基因功能喪失作用，從而使部分功能被屏蔽，並可進一步對生物體造成影響，進而推測出該基因的生物學功能。
同源重組簡單講就是同源序列的重新組合，至於這個原理在此貼出來一個連接大家可以學習一下（https://www.bilibili.com/video/BV1Ns41167Vh/?p=20 ；https://haokan.baidu.com/v?vid=5699605495593153262&pd=bjh&fr=bjhauthor&type=video）。這個視頻詳細的解釋了同源重組的分子機制，在此就不詳細解釋了（視頻對以下內容很重要，所以還請優先觀看視頻後再學習以下內容）。
一、ATMT（豹豹）
所需材料：目的基因片段上下遊同源序列，含有轉座子的質粒，感受態農桿菌等；
同源重組敲除原理如下圖（原理圖可以看本期讀書筆記）：
如圖所示，下面彎曲的片段即是帶有上下遊同源片段以及潮黴素作為篩選基因的Ti質粒，通過農桿菌侵入介導質粒轉移。大致流程(以稻瘟菌為例)：
1、同源臂片段的獲取、敲除質粒構建（省略載體構建的步驟，一定要驗證，確保質粒的正確，否則以後實驗失敗溯源很難查到這一步）；
2、含有Ti質粒的農桿菌製備：將Ti質粒導入到農桿菌中，常見運用的方法就是電擊轉化，將感受態農桿菌和質粒同時置於電擊杯，電擊後於培養基培養兩至三天（本方法為電擊轉化方法），菌落PCR驗證轉化結果。（插一個農桿菌感受態製備以及電轉的方法僅供參考 http://muchong.com/html/201105/2734785.html）；
3、真菌細菌共培養：將轉化後的農桿菌和稻瘟菌的孢子（孢子＞105個/ml，不同的菌需要不同的菌量）在鋪有硝酸纖維素膜的PA（加氨苄；加乙醯丁香酮，誘導質粒的水平轉移）板上培養；
4、轉板初篩：共培養約3天後，將其帶有共轉產物的硝酸纖維素膜切下放於PBS溶液中懸浮，取適量懸浮液塗在PA（加潮黴素濃度約為平時搖菌濃度的3~4倍，做陽性篩選；加卡那黴素，殺死農桿菌）平板上，吹乾封板，避光培養直至菌絲長出。
5、轉板復篩：將初篩板上長成的轉化子挑取放於復篩板中（復篩板中的潮黴素濃度較初篩板更高），繼續培養。
6、以SDS鹼裂解法粗提轉化子DNA，並驗證。對於驗證敲除成功的突變體及時記錄並存菌。
二、基於融合PCR為基礎的同源重組（阿金）
（這個師弟心裡有一臺戲，喜歡自言自語；竟然還有喜歡敲回車鍵的惡趣味，好多空行，不過已被我刪除了）
這裡有很多要普及的內容，例如PCR技術，同源重組，引物合成，還有融合PCR等等……
簡單來說(•̀⌄•́)，PCR技術就是體外擴增DNA，要合成引物才能進行PCR。（這裡引物合成是關鍵，劃重點(⊙o⊙)，稍後再講解）
至於同源重組，是指外源DNA與受體細胞染色體DNA上的同源序列之間發生重組，並整合在預定位點上，從而改變細胞遺傳特性的方法。
融合PCR呢，簡單來說就是通過PCR技術將兩個或兩個以上基因片段連接起來。通常包括兩次PCR，第一次是分別擴增基因片段，第二次是擴增同源重組後基因片段。
假設你要連接兩個基因片段，基因A和基因B
如果是普通PCR擴增基因A和基因B，設計引物按如圖就可以了，將紅色框的模板序列發給生物公司，PCR時合成的引物會向箭頭方向擴增。
如果是用於融合PCR，就要在前基因（也就是A）的後引物加上基因B前引物的互補序列（下圖下面藍色實框）
同時，基因B的前引物要加上基因A後引物的互補序列（下圖上面藍色實框），（互補序列不能直接搬運，要注意序列5』和3』方向），這裡肯定會暈倒一大批人，因為小金我就在這暈倒了
各自添加後就可以發給生物公司合成引物，引物會連接到模板鏈，按箭頭方向進行PCR擴增。|･ω･｀)
分別經過PCR後，各自擴增的基因片段如下圖，這就形成了很關鍵的同源部分（藍框顯示）
在第二次PCR時，用基因A前引物和基因B的後引物作為引物對，在有同源序列的情況下，就會有機率發生同源重組，就會擴增出拼接好的基因A和基因B
這樣就大功告成啦•ᴗ•（撒花），多片段拼接原理也是這樣。
融合PCR相對於傳統的融合基因重組構建來說，後者是以限制性內切酶和DNA連接酶為基礎，這不僅需要對DNA片段的限制性酶切位點有所了解，同時在連接過程中還引入了不必要的酶切位點鹼基序列，融合PCR 就能很好地克服傳統的融合基因重組構建方法的缺陷。
這就是全部內容了，希望大家批評指正。
原來小金我和馬雲的距離只差個同源序列
參考文獻
1.馬先勇,姚開泰.同源重組技術研究進展
2.賈琪,孫新立.植物基因打靶的研究與應用
3.李敏,楊謙.一種高效構建同源重組DNA片段的方法——融合PCR
4.百度百科
師弟步驟呢？
還是不能省心呀，依然需要補充，那麼我就把原生質體轉化的步驟簡單描述一下。
感覺不要太簡單呀。（以黑粉菌為例，稻瘟菌也有但是我沒具體操作過就不拿出來了）
PEG介導的甘蔗鞭黑粉菌原生質體轉化（忽略其中可能潛在的問題，主要是流程，具體的本實驗室發文章中均可以查到）
一、原生質體轉化實驗的關鍵：
原生質體製備（全部量足夠做一個基因）
1、種子液：wt17→YePS（+A+C） 28 ℃ 200 rpm 1-2天1.5離心管搖菌
2、擴大培養：1：100稀釋（600 μL→60 mL YePS(+A+C)）28 ℃ 200 rpm 約6~7 h
3、測OD600≤0.8（0.6~0.7最好）
4、收集菌體：50mL離心管（可多次收集） 1000g 10 min 4 ℃
5、消細胞壁：加入現配現用的細胞壁裂解酶溶液，50 mL菌液加2 mL，輕輕混勻。28~30℃孵育約30 min以除去細胞壁，轉入冰上操作
6、鏡檢：可見球形原生質體
7、洗滌：加入8 mL SCS ×500g 10 min 4 ℃
加入10 mL SCS ×500g 10 min 4 ℃
加入10 mL SCS ×500g 10 min 4 ℃
加入10 mL STS ×500g 10 min 4 ℃
8、重懸：加入2~3 mL STC 用槍頭輕輕混勻重懸，置於冰上（可在冰上多個小時保存）
二、PEG介導的原生質體轉化
1、取目的基因1-5 μL（體積小於10 μL，即濃度達到100-500 ng/μL）
2、加入1 μL肝素鈉（15 μg/μL）
3、加入50 μL原生質體，冰上10分鐘
4、加入500 μL 40% PEG，輕輕混勻，冰上15 min
5、加入45 ℃保存的YePS-soft輕搖勻，倒板約5 mL/板
6、晾板，28 ℃培養3-5天，挑菌篩選
三、RNAi幹擾技術（阿甘）
這一部分是贈送環節了，寒假前還在研究如何把這個應用到我們黑粉菌上面。所以就找了甘師弟灌水這部分內容。
RNAi即RNA interference縮寫。先大概回顧其定義，一些小的雙鏈RNA可以高效特異、阻斷胞內特定基因的表達，促使mRNA降解或被抑制，誘使細胞變現出特定基因缺失的表型。若是表達的是siRNA（小幹擾RNA，目的mRNA的同於互補序列），則特定降解目的mRNA；若是表達shRNAs（短髮夾RNA），則是在目的mRNA上形成髮夾抑制表達。
至於提到如何利用RNAi進行基因敲除，則以表達siRNA的RNAi體系為例，大致流程如下：
1、通過資料庫或網絡途徑獲得所需要敲除的目的基因序列，例如可以通過NCBI等網站直接獲得該序列。而後根據所需長度，設計對應引物，擴增得到該目的基因片段。
2、選用表達載體方面，則需要通過查找相關文獻或預實驗，取可以在目的細胞內穩定表達的載體。所採取的載體應附帶相關篩選標籤，當然也可後期改造添加適合的篩選標籤，方便後續操作。
3、構建RNAi體系，具體則是將擴增得到的目的基因片段連接於載體上。這個系統對於目的基因在載體上的位置，是有要求的：目的基因位於兩個反向啟動子之間——即目的基因所在位置的上下遊，都要有啟動子，且兩個啟動子的方向是相反的，即所謂反向雙啟動子載體。
這裡作者從文獻上看到一個更巧妙構建的思路，預先在目的細胞中加入篩選標籤基因，並培養至穩定表達；而在構建RNAi載體時，將篩選標籤也連接在兩個反向啟動子之間，即與目的基因相鄰，最後再轉入含有篩選標籤基因的目的細胞。如此結果是目的細胞的篩選標籤與目的基因同時沉默，提高了篩選的準確性和效率。
4、在構建好RNAi載體後，需要獲得大量的複製體。一般的方法是轉入原核細菌如大腸桿菌中，按需培養後提取質粒即可，操作簡便價格低廉。
5、最後則是將RNA載體轉入目的細胞中，進行「敲低」。轉化的方法多種多樣，便不贅述。
經此一役，RNAi「敲除」的上遊部分大抵完成，以下是簡略流程圖，方便理解：
註：最近版權問題又在風口浪尖了，聲明一下部分圖片和連結來自網上，由於是技術貼所以不存在原創只有總結。