科學家如何操縱基因表達？| 基因的敲除和敲入

基因就像程式設計師寫的程序，不同的程序，運行起來的效果就不一樣。程序就是一串串的代碼，類似的，基因就是由DNA組成的一串串代碼。簡單地講，基因就是四種鹼基ATCG不同的排列組合。

那麼，什麼是基因編輯呢？

基因編輯，即對基因進行切除、添加、或變換，從而改變DNA的排列順序。

個體的發育是從一個細胞——受精卵——發育而來，基本上，當時那個受精卵的基因，就是後來發育成的個體的基因。

也就是說，受精卵通過分裂，一生二，二生四，四生八，八生無數。在此過程中，DNA也在不停複製，分配到新生的細胞中去。所以，我們人體的所有包括皮膚、心肝肺脾、大腦、骨頭、血液等器官內的細胞，其基因基本相同。

如果想要改變整個個體的基因，那就需要從受精卵開始進行基因編輯。如果只是改變局部細胞的基因，那就從局部編輯基因，不需要從受精卵開始。

基因編輯包括基因的敲除、敲入、變換等，目前最常用的基因編輯工具即CRISPR/Cas系統。

CRISPR/Cas9敲除技術

CRISPR，即Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，翻譯過來就是規律間隔的成簇短迴文序列。而Cas，即CRISPR相關（associated）蛋白；Cas9就是CRISPR相關蛋白9。Cas9是一個核酶，能夠切割核酸。CRISPR/Cas9技術也被稱為基因的「魔剪」。

作為一個切割DNA的酶，Cas9是如何確定去切割DNA上的哪個基因呢？

這就需要嚮導RNA（guide RNA），也叫gRNA。gRNA是一段單鏈的RNA序列，可以指導Cas9到達切割的位點。

首先，gRNA是一段和基因上特定序列互補的一段單鏈RNA序列，大小約20bp。Ca9能夠和gRNA結合在一起，而gRNA能夠錨定到特定的基因序列上。因此，gRNA帶領Cas9這個酶來到特定的切割位點，切開基因。Cas9像一把剪刀，能夠使DNA雙鏈斷裂。

當基因發生雙鏈斷裂時，細胞需要對斷裂的基因進行及時修復，否則，基因雙鏈斷裂對細胞來說通常是致命的，會引起細胞凋亡。

細胞如何修復斷開的基因呢？通常有兩種主要的方式：非同源末端連接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）和同源重組修復（Homologous Directed Repair，HDR）。通過DNA修復，斷裂的基因能夠重新連接起來。

• 非同源末端連接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）

NHEJ是一種快速非精確的DNA修複方式。當基因組發生斷裂時，細胞可以通過在斷裂位點增加或減少幾個鹼基，快速將斷裂的基因連接起來。由於在修復過程中，基因的鹼基發生了變化，減少一個或多個鹼基，因此基因的序列就發生了變化。產生突變的基因無法正常表達出蛋白質，就失去了功能。

• 同源重組修復（Homologous Directed Repair，HDR）

同源重組修複方式需要一段同源序列作為模板。例如，當一條染色體發生斷裂時，同源染色體上相應的片段可以作為同源序列，使斷裂的基因重新合成。這種修複方式是精確的，一般不會改變基因的序列。

當兩條染色體同時發生斷裂時，細胞沒有內源的同源染色體作為模板，就無法進行同源重組修復。此時，非精確的NHEJ是主要的修複方式。如果細胞內沒有這種快速的修複方式，那麼基因組斷裂對於細胞來說就是致命的，修復不好細胞就會走向凋亡。

NHEJ修複方式會產生突變，產生的突變對物種的進化有一定的貢獻。

通常情況下，NHEJ的修複方式效率更高，更快，但是不精確，會引起基因序列的變化，影響基因功能。相反，HDR的修複方式效率較低，速度較慢，並且需要另一條染色體上的同源序列，但是非常精確，不造成基因序列的變化，基因功能不變。

當gRNA像嚮導一樣帶領Cas9來到特定的基因上以後，Cas9切割DNA造成雙鏈斷裂，隨後，細胞通過內部的修複方式，將斷裂的DNA重新連接起來。

從細胞群體來看，有的細胞會發生NHEJ修復，有的細胞會發生同源重組修復。這時，科學家就需要挑選那些發生了NHEJ修復，基因發生突變的細胞。

那些使用同源重組修複方式修復DNA斷裂口的細胞，基因沒有突變，也就沒被敲除，這種細胞就不能要。

當科學家們通過篩選得到那些失去特定基因的細胞時，就完成了一個基因敲除的過程。

然而，想要敲入基因時，HDR修複方式的細胞則會成為科學家們想要的細胞。

CRISPR/Cas9敲入技術

當科學家需要基因敲入時，就必須提供一個外源片段，充當同源重組修復的同源系列。待敲入的目標基因便藏於這一外源片段中。

Cas9酶在gRNA的引導下，切割目標DNA。隨後，DNA修復發生。

當細胞利用同源重組修複方式，以此片段為模板，在斷裂處合成與同源序列互補的基因序列，這樣就實現了基因敲入的目的。

同樣，細胞群體裡仍然會有一部分利用NHEJ修復斷裂的DNA鏈，這些細胞沒有實現基因敲入，需要篩選掉。

總結

CRISPR/Cas9介導的基因敲除和敲入，高效、精確、價格低廉，是最熱門的基因編輯技術，也是諾貝獎的熱門候選。除了在DNA上編輯，CRISPR/Cas系統還可以在mRNA上操作，實現基因的敲減，即不影響DNA，只降解mRNA，從而實現功能蛋白的表達量降低。下篇文章，我們一起看一下CRISPR/Cas系統實現的基因敲低。