細胞技術討論——RAW264.7的基因敲除心得

2020-11-09 海星生物

小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7在炎症、免疫、凋亡、腫瘤研究中應用廣泛，由於RAW264.7能夠進行胞飲和吞噬作用，所以被廣大科研者認為是巨噬細胞地最佳模型之一。

對於如何解決RAW264.7細胞的基因敲除，也是海星生物-cas9x.com的一個重要的研發方向，歷時一年多的研發，我們終於在技術層面解決了這個RAW264.7細胞株的基因編輯的難題，可以為客戶提供編輯效率高、結果穩定、周期快速的細胞基因敲除的解決方案。

RAW264.7細胞基因敲除/基因敲入/基因突變的技術流程如下：

一、 RAW264.7細胞的培養條件及其注意事項

RAW264.7細胞使用的培養條件為：DMEM高糖+10%FBS。RAW264.7細胞對血清質量要求比較高，建議使用高質量胎牛血清。

RAW264.7細胞具有兩種狀態：

1、 未活化的RAW264.7細胞：通常形態呈圓形，貼壁黏附能力較弱；

2、 活化的RAW264.7細胞：一旦受到刺激活化RAW264.7細胞會長出偽足，黏附能力增強，同時細胞表面活化的Marker也會增加表達。

所以在RAW264.7細胞的培養過程中，要及時換液和傳代，否則，飢餓的細胞狀態會急劇惡化，出現大量偽足，且不可逆轉，最後，細胞生長速度會變得十分緩慢。

【ATCC官網RAW264.7細胞培養照片】


由於我們對RAW264.7細胞傳代和換液的頻率控制得比較好，大幅的改善了RAW264.7細胞的狀態。下圖是RAW264.7的細胞狀態圖片。

【RAW264.7細胞培養照片】

二、 RAW264.7細胞的轉染條件優化

海星生物-cas9x.com會根據每個細胞的特性優化其電轉條件，其中就包括電轉緩衝液的優化，我們嘗試在電轉緩衝液中加入了吸附劑，可以大大促進DNA吸附到細胞的表面，同時還加大的緩衝液的電阻，從而可以提供電轉的電壓，大幅度的提升了電轉的效率，是傳統緩衝系統的3-5倍的效率，達到80%。同時由於提高了細胞的存活率到90%，所以細胞的基因編輯的效率也得到了大幅度提升。

【GFP表達載體電轉後72小時對比圖片】

3、RAW264.7細胞的快速克隆化條件優化；

由於使用了ClonePlus技術，RAW264.7的細胞克隆形成能夠達到95%以上，而且克隆形成的時間也縮短到1-2周的時間，大大壓縮了整個克隆檢測的時間周期。（而傳統的克隆過程需要1個月）

VIRUS-Free技術，與病毒法相比，效率更高，周期更短，而且可以規避病毒重新複製的風險。懸浮細胞與貼壁細胞相比，其藥物抗性篩選難度大，單克隆化效率低，再加上基因定點突變效率遠低於基因敲除效率，兩種因素疊加導致拿到的突變純合子的概率極低。

ClonePlus技術, 採用專有的膠體表面處理，RAW264.7細胞株的克隆率超過95%，可以輕鬆進行克隆分離和克隆PCR鑑定，大幅度的提高了細胞的鑑定陽性率。



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