Crispr技術基因敲除細菌-源井生物

2020-08-23 源井生物科技


科學家們已經開發出一種基於CRISPR-Cas9系統的連續基因敲除細胞系技術，包括單個和多個（最多三個）靶基因插入和敲除，目的是進行細菌修飾。 CRISPR/Cas系統是一種原核免疫。系統對外源遺傳元件（例如在質粒和噬菌體中發現的那些）的抗性可以提供某種形式的獲得性免疫。具有間隔序列的RNA可以幫助Cas蛋白識別和切割外源DNA。 RNA引導的其他Cas蛋白可以切割外源RNA。在大約40％的細菌基因組序列和90％的古細菌序列中發現CRISPR。


通過CRISPR-Cas9系統在基因敲除大腸桿菌中進行多次基因編輯

工業上有用的微生物的構建需要有效的基因組規模的編輯工具。研究人員描述了一種靶向，連續的多基因編輯策略，該策略使用化膿鏈球菌II型CRISPR-Cas9系統應用於大腸桿菌基因組，以實現多種精確的基因組修飾，包括基因刪除和插入，效率最高是100％，它可以同時在三個目標上執行多基因編輯。該系統還證明，它成功地在另一種Enterobacteriaceae-Tatumella citrea中實現了靶向染色體缺失，效率高達100％。


使用CRISPR / Cas9在大腸桿菌中進行多個逐步基因敲除

隨著最近使用CRISPR / Cas9技術作為基因組編輯的標準工具，世界各地的實驗室都經歷了自PCR以來最大的分子生物學進展之一。該方法的主要優點是它的簡單性和對任何類別的通用性。特別令人感興趣的是被廣泛研究的革蘭氏陰性細菌大腸桿菌，因為它被認為是研究和工業應用的主要力量。研究人員提出了一種使用CRISPR/Cas9系統與λRed機器相結合的簡單，可靠和有效的方案，用於在大腸桿菌中進行基因敲除。在我們的程序中，至關重要的是使用雙鏈供體DNA和一種固化策略來去除編碼RNA的引導質粒，該質粒允許僅在兩個工作日內引發新的突變。我們的協議允許具有高誘變效率的多個逐步敲除菌株適用於高通量方法。


全基因組多功能CRISPR系統用於高通量基因型-表型作圖

由於我們對細胞網絡的了解有限，因此基因組規模的工程設計是了解基因組功能必不可少的工具。不幸的是，大多數現有的全基因組和基因型-的作圖方法僅限於基因組改變的單一模式，即過度表達，抑制或缺失。研究人員報告了一種通用的全基因組CRISPR（MAGIC）系統，該系統可將所需基因在整個基因組中的表達水平精確控制在所需水平。據我們所知，通過將三功能CRISPR系統與由陣列合成的寡核苷酸文庫結合，MAGIC被用於創建酵母中最全面和多樣性的基因組文庫之一。 MAGIC的能力通過鑑定以前未表徵的複雜表型遺傳決定子來證明，尤其是當擾動到不同表達水平時具有協同相互作用的決定子。 MAGIC代表了強大的合成生物學工具，可用於研究基本生物學問題並設計用於生物技術應用的複雜表型。

Ubigene已開發出CRISPR-B™以優化微生物基因編輯載體和工藝。效率和準確性遠高於傳統方法。 CRISPR-B™可用於細菌和真菌的基因編輯。


Reference

Endo M, Mikami M, Toki S. Multigene knockout utilizing off-target mutations of the CRISPR/Cas9 system in rice. Plant Cell Physiol. 2015;56(1):41-47. doi:10.1093/pcp/pcu154

König, Enrico & Zerbini, Francesca & Zanella, Ilaria & Fraccascia, Davide & Grandi, Guido. (2018). Multiple Stepwise Gene Knockout Using CRISPR/Cas9 in Escherichia coli. BIO-PROTOCOL. 7. 10.21769/BioProtoc.2688.

Jiazhang Lian, Carl Schultz, Mingfeng Cao, Mohammad HamediRad,Huimin Zhao.Multi-functional genome-wide CRISPR system for high throughput genotype–phenotype mapping.Nature Communications .2019.

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調控記錄的能力，而且具有多種優勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統。首先，它在穀氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達可以快速產生重組蛋白。第三，可用於穩定的重組蛋白生產。一些研究人員利用基因細胞敲除切割效率系統產生基因編輯細胞系，對GLUL基因組位點進行靶向測序，產生了EPO的穩轉細胞系，並發現重組促紅細胞生成素在人體內穩定表達的機制。


源井生物根據科研需求，結合靶基因的情況進行基因穩轉敲除方案設計。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設在外顯子2兩端的內含子中，敲除外顯子編碼鹼基數為非3倍數，敲除後可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設在外顯子上，缺失的鹼基數為非3倍數，敲除後可發生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達到大片段敲除的效果。


註明 | 文章是源井生物原創，轉載請註明。

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