分享Hela 敲除細胞的運用-源井生物

2020-12-05 源井生物

HeLa細胞介紹

HeLa細胞與其他細胞系一樣，被稱為科研中的不朽細胞系，只要在適宜的環境中保持和維持，HeLa細胞在實驗室細胞培養板中可以無限次分裂。在基因編輯研究中，HeLa細胞成為CRISPR/Cas9 KO細胞系。

HeLa細胞是最古老和最常用的人類細胞系，也是最常用的CRISPR細胞系。該細胞系起源於1951年一位31歲的非裔美國婦女的宮頸癌細胞。從這一細胞系中觀察到的細胞生長速度非常快，每20-24小時增長一倍，這與之前死亡的其他樣本不同。該細胞系具有高度的持久性和多產性，因而在科學研究中得到了廣泛的應用，如HeLa基因敲除細胞系。

HeLa細胞的應用

自從1953年HeLa細胞是第一個成功克隆的人類細胞以來，它們一直被用於研究癌症、愛滋病、輻射和有毒物質的影響、基因定位和無數其他科學研究。例如，Jonas Salk在20世紀50年代用HeLa細胞測試了第一個脊髓灰質炎疫苗使HeLa細胞非常適合脊髓灰質炎疫苗試驗，因為結果很容易獲得。此外，HeLa細胞也有助於人類乳頭瘤病毒（HPV）疫苗的開發。

1965年，亨利·哈裡斯和約翰·沃特金斯將HeLa細胞與小鼠胚胎細胞融合，創造了第一個人-動物雜交種。這使得將基因定位到特定染色體的研究取得了進展，最終將導致人類基因組計劃，包括CRISPR技術的基因敲除和基因敲除。

1） CRISPR/Cas9建立SQSTM1/p62基因敲除Hela細胞

為了探索CRISPR/Cas9基因編輯對p62 sgRNA的有效性，研究人員成功地利用CRISPR/Cas9基因編輯技術將p62基因敲除。採用細胞稀釋法和嘌呤黴素篩選法分別確定雙sgRNA和單sgRNA引導基因編輯的成功率。Western blot分析表明，雙sgRNA定向p62基因敲除效率高於單sgRNA定向p62基因敲除效率。靶序列測序分析提示p62編碼基因存在較大的缺失突變。H2O2處理後Hela細胞穩定敲除結果表明，p62基因敲除能顯著抑制H2O2誘導Hela細胞早期凋亡。因此，成功建立了p62基因敲除Hela細胞系。雙sgRNA引導的CRISPR/Cas9基因編輯系統可能是一種更有效的編輯工具。

2）利用CRISPR/Cas9基因編輯系統構建穩定的Cdc25C基因敲除HeLa細胞株

利用CRISPR/Cas9基因編輯系統對人宮頸癌HeLa細胞分裂周期25同系物C（Cdc25C）基因進行敲除，構建Cdc25C基因穩定敲除細胞系。該方法基於CRISPR/Cas9靶點設計規則，設計特異識別Cdc25C基因第一外顯子相關序列的上下遊小導RNA（sgRNA），構建真核重組表達質粒。經測序鑑定後，將重組質粒導入HeLa細胞，通過puromycin（puromycin）抗性篩選，穩定地敲除Cdc25C基因細胞株，然後用Western blotting鑑定Cdc25C的敲除效果。最後，用流式細胞儀檢測基因敲除對細胞周期的影響。結果篩選出Cdc25C基因敲除穩定的細胞株，Cdc25C敲除對細胞G2/M期進程有明顯影響。結論利用CRISPR/CAS9技術成功地獲得了內源性CDC25C基因敲除細胞系，研究CDC25C在細胞周期過程中的作用，為相關癌症的發生奠定了基礎。

CRISPR/Cas9基因敲除HeLa細胞系的策略

敲除HeLa細胞株的工作流程

Reference:

5 Contributions HeLa Cells Have Made to Science. Cell Science from Technology Networks. Retrieved 2020-03-25.

Yao Ye-bao, Wang Guang-fei, Dong Qing-cai, Cao Cheng. Construction of stable Cdc25C knockout HeLa cell strains using CRISPR/Cas9 gene-editing system, Military Medical Sciences, 2019,42(1):1-5.

Huang Rongfu, Peng Weilin, Lin Jiansheng, Lian Jianfeng, Yang Xiaoyu, Zheng Ming. Construction of stable Cdc25C knockout HeLa cell strains using CRISPR/Cas9 gene-editing system. Military Medical Sciences, 2017,41(5):359-362

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