基因敲除大腸桿菌的代謝通量分析-源井生物

大腸桿菌（又稱大腸埃希氏菌）是革蘭氏陰性，兼性厭氧，棒狀大腸埃希氏菌，通常存在於溫血生物的小腸（吸熱）中。大多數的大腸桿菌菌株是無害的，但某些血清型可導致宿主食物嚴重中毒，有時還會因食物汙染而召回產品。無害的細菌菌株是正常腸道菌群的一部分，可以通過產生維生素K2並防止病原菌在腸道內定殖而具有共生關係，從而使宿主受益。大腸桿菌通過糞便排洩。在有氧條件下，該細菌在新鮮糞便中大量生長3天，但隨後緩慢減少。由於實驗室培養的悠久歷史和簡便的操作，基因敲除細胞系大腸桿菌在現代生物工程和工業微生物學中起著重要的作用。 [82] Stanley Norman Cohen和Herbert Boyer在大腸桿菌中的工作，利用質粒和限制酶產生重組DNA，成為生物技術的基礎。

基於13C標記實驗的pykF敲除大腸桿菌的代謝通量分析以及酶活性和細胞內代謝物濃度的進行了測量

基於13C標記實驗的代謝通量分析，然後使用2D NMR和GC-MS測量細胞內同位素分布，以研究丙酮酸激酶（pyk）基因敲除對連續培養的大腸桿菌代謝的影響。另外，在分批培養和連續培養中，測量16種酶的活性5種細胞內代謝物的濃度隨時間變化。發現與野生型相比，在pykF突變體中通過磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和蘋果酸的通量被上調，並且在突變體中乙酸鹽的形成顯著減少。另外，在突變體中，通過磷酸果糖激酶途徑的通量減少，而通過氧化戊糖磷酸（PP）途徑的通量增加。這由相應的酶活性和磷酸烯醇丙酮酸，6-磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖酸酯的濃度證明。還發現對於連續培養，氧化PP和Entner-Doudoroff的酶活性。 pykF突變體的稀釋度隨著途徑的增加而增加。為了定量地闡明新陳代謝，重要的是發現整合有關細胞內代謝通量分布，酶活性和細胞內代謝物濃度的信息。

使用CRISPR-Cas9重建涉及I-異亮氨酸雙加氧酶的TCA循環以在大腸桿菌中羥化I-異亮氨酸

L-異亮氨酸雙加氧酶（IDO）是鐵（II）/α-酮戊二酸（α-KG）依賴性雙加氧酶，可將L-異亮氨酸（I-Ile）轉換為特異（2S，3R，4S）-4-羥基異亮氨酸（4-HIL）。4-HIL是用於治療和預防1型和2型糖尿病的重要藥物，但目前的方法收率低。在這項研究中，CRISPR-Cas9基因編輯系統被用於基因敲除大腸桿菌TCA循環途徑中的sucAB和aceAK基因。對於單基因敲除，整個過程大約需要7天。但是，進行多輪編輯的每一輪遺傳修飾時間減少了2天。使用基因組編輯的重組菌株大腸桿菌BL21（DE3）ΔsucABΔaceAK/ pET-28a（+）-ido（2Δ-ido），與大腸桿菌相比，L-Ile對4-HIL的生物轉化率提高了約15％ 。大腸桿菌BL21（DE3）/ pET-28a（+）-ido [BL21（DE3）-ido]菌株。CRISPR-Cas9編輯策略具有更快速地修飾多個基因並優化用於工業生產的菌株的潛力。

敲除qseB的CRISPR-Cas9誘導基因敲除大腸桿菌運動性和生物膜形成之間的異步

通常，細胞運動性和生物膜形成受到嚴格調節。 QseBC兩組分系統（TCS）充當細菌信號傳遞的橋梁，其中QseB蛋白充當細菌運動性，生物膜形成和毒力的響應調節劑。通常，已經研究了控制QseBC及其功能之間相互作用的機制，但目前尚不清楚QseB如何調節細菌運動性和生物膜形成。在這項研究中，使用CRISPR-Cas9系統構建了大腸桿菌MG1655ΔqseB菌株（ΔqseB菌株），並確定了qseB基因對野生型（WT）運動性和生物膜形成的影響。活力測定結果表明，ΔqseB菌株比WT菌株具有更高的（p <0.05）活力。但是，ΔqseB和WT菌株之間的生物膜形成沒有差異。

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調控記錄的能力，而且具有多種優勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統。首先，它在穀氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達可以快速產生重組蛋白。第三，可用於穩定的重組蛋白生產。一些研究人員利用基因細胞敲除切割效率系統產生基因編輯細胞系，對GLUL基因組位點進行靶向測序，產生了EPO的穩轉細胞系，並發現重組促紅細胞生成素在人體內穩定表達的機制。

根據科研需求，結合靶基因的情況進行基因穩轉敲除方案設計。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設在外顯子2兩端的內含子中，敲除外顯子編碼鹼基數為非3倍數，敲除後可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設在外顯子上，缺失的鹼基數為非3倍數，敲除後可發生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達到大片段敲除的效果。

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