基因編輯釀酒酵母深度解析-源井生物

釀酒酵母是酵母的一種。自古以來，它就一直用於釀酒，烘焙和釀造。據信，它最初是從葡萄皮中分離出來的人們可以將酵母看作是一些深色水果（如李子）的皮膚上白色薄膜的成分；它存在於表皮的蠟中。它是分子和細胞生物學中研究最深入的真核生物模型之一，同時也可用作基因敲除大腸桿菌（Escherichia coli）的模型細菌。它是最常見的發酵類型微生物。

磷酸甘油酸突變酶敲除突變體釀酒酵母：生長調查和轉錄組分析

釀酒酵母是能夠通過糖的異生作用來激活的，使其新陳代謝可以適應不同碳源的生長，並轉變為C2或C3碳源（乙醇，乙酸鹽或甘油）的非發酵生長。研究人員研究了編碼磷酸甘油酸突變酶的糖酵解和糖異生基因GPM1缺失的反應。先前已證明，只有當甘油和乙醇均作為碳源存在時，帶有GPM1的非功能性拷貝的釀酒酵母菌株才能生長，而添加葡萄糖顯示出強烈抑制生長的作用。提示需要甘油來促進糖異生，而呼吸需要乙醇。研究人員通過發酵和轉錄組分析研究了GPM1敲除突變體的生長反應。此外，研究人員將生長結果與通過使用的基因組，促進新陳代謝模型進行模擬獲得的結果然後再進行了比較，結果表明，甘油僅需少量即可用於生長。我們的發現強烈暗示了敲除突變體的生長能力嚴重受損，該突變體呈現出參與戊糖磷酸途徑和乙醛酸分路的基因的轉錄水平增加。這些結果表明試圖補償由突變體內糖酵解/糖異生基因的缺失引起的能量失衡。

通過基於CRISPR的FDC1基因編輯能夠減少酚類異味，釀酒酵母x多種啤酒酵母

當今的啤酒市場面臨著減少傳統啤酒風格消費和增加特種啤酒消費的挑戰。尤其是啤酒（比爾森啤酒），其特徵是清爽，獨特的香氣和味道，但非常均勻，因此很難與它們的銷售競爭。現在已經提出了開發普通啤酒酵母的新變體，巴斯德酵母等夾雜著多種釀酒酵母。（Saccharomyces pastorianus）作為解決啤酒中產品多樣化需求的解決方案。以前通過祖先親本物種（釀酒酵母和歐亞酵母）雜交產生新的更大的酵母的努力產生了具有不同於自然生物多樣性的芳香特徵的菌株。不幸的是，這些新酵母除了具有理想的特性外，還繼承了多餘的特性。最值得注意的是它們的酚醛異味（POF）生產，這妨礙了它們在工業生產過程中的直接應用。研究人員描述了一種基於CRISPR的基因編輯策略，該策略可以系統地，精心地引入遺傳上複雜的工業釀酒酵母菌株，桑巴酵母和FDC1基因中的自然突變。所得的順式POF變異體顯示出巨大的工業應用潛力，並使目前的大型啤酒產品組合多樣化。

基於CRISPR / Cas9的釀酒酵母乳出口難以捉摸的機制探索

CRISPR/Cas9的基因組編輯可快速，同時修改釀酒酵母中的多個遺傳基因座。這項技術被用於功能分析研究中，目的是確定迄今為止該酵母中乳酸輸出的未知機制。構建了釀酒酵母菌株，該菌株在25個編碼轉運蛋白的基因中缺失，包括完整的水（甘油）蛋白家族和所有已知的羧酸轉運蛋白。然後用乾酪乳桿菌乳酸脫氫酶（LcLDH）的表達盒轉化25缺失菌株。在厭氧，葡萄糖生長的分批培養中，該菌株的比生長速率（0.15 vs. 0.25 h-1）和生物量特異性乳酸產生速率（0.7 vs. 2.4 mmol g生物量-1 h-1）低於LcLDH-表達參考菌株。然而，在厭氧葡萄糖有限的恆化器培養物中兩種菌株的比較（稀釋率0.10 h-1）顯示出相同的乳酸產生率。這些結果表明，儘管25個轉運蛋白基因的缺失影響了最大的生長速率，但是當以固定的生長速率進行分析時，它並不影響乳酸鹽的出口速率。

25缺失菌株為邁向「最小轉運蛋白」酵母平臺邁出了第一步，該平臺可用於特異性（異源）轉運蛋白的功能分析以及代謝工程策略的評估。

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調控記錄的能力，而且具有多種優勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統。首先，它在穀氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達可以快速產生重組蛋白。第三，可用於穩定的重組蛋白生產。一些研究人員利用基因細胞敲除切割效率系統產生基因編輯細胞系，對GLUL基因組位點進行靶向測序，產生了EPO的穩轉細胞系，並發現重組促紅細胞生成素在人體內穩定表達的機制。

根據科研需求，結合靶基因的情況進行基因穩轉敲除方案設計

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設在外顯子2兩端的內含子中，敲除外顯子編碼鹼基數為非3倍數，敲除後可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設在外顯子上，缺失的鹼基數為非3倍數，敲除後可發生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達到大片段敲除的效果。

Reference

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Mertens S , Gallone B , Steensels J , et al. Reducing phenolic off-flavors through CRISPR-based gene editing of the FDC1 gene in Saccharomyces cerevisiae x Saccharomyces eubayanus hybrid lager beer yeasts[J]. Plos One, 2019, 14(1).

Robert, Mans, Else-Jasmijn, et al. A CRISPR/Cas9-based exploration into the elusive mechanism for lactate export in Saccharomyces cerevisiae.[J]. FEMS yeast research, 2017.

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