施一公研究組發文報導釀酒酵母剪接體處於完成RNA剪接後構象的高...

施一公研究組發文報導釀酒酵母剪接體處於完成RNA剪接後構象的高解析度結構

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清華新聞網11月18日電 11月17日，清華大學生命學院施一公教授研究組在《細胞》（Cell）期刊再次發表剪接體結構與機理的最新研究成果。這篇題為《釀酒酵母「催化後剪接體」的結構》（Structure of the Post-catalytic Spliceosome from Saccharomyces cerevisiae）的論文，報導了釀酒酵母剪接體呈現RNA剪接反應完成後狀態（定義為「P複合物」）以及其整體解析度為3.6埃的三維結構，並首次展示了mRNA前驅體中3』剪接位點的識別狀態。該結構為回答RNA剪接反應過程中mRNA前驅體中的3』剪接位點如何被識別，第二步轉酯反應如何發生，以及成熟的mRNA如何被釋放等關鍵問題提供了重要結構信息。

1977年，科學家們首次發現來自於腺病毒的mRNA與其對應的DNA轉錄模板並不能形成連續的雜交雙鏈，而是在雜交雙鏈的不同位置伸出了環狀的DNA單鏈。這個重大發現表明，遺傳信息從DNA傳遞到mRNA上並不只是通過轉錄，還需要mRNA前驅體剪接來進一步完成「無效」遺傳信息的去除與有效遺傳信息的拼接。「無效」的遺傳信息不具有翻譯功能，被稱為內含子；而可以被核糖體翻譯的有效遺傳信息叫做外顯子。內含子被去除、外顯子被連接這一過程即為RNA剪接。RNA剪接普遍存在於真核生物中，隨著物種的進化，含有內含子的基因數量增加，發生RNA剪接的頻率也相應增高，使得一個基因編碼多個蛋白質成為可能，極大的豐富了蛋白質組的多樣性，也是真核生物多樣性的重要原因之一。

RNA 剪接是真核生物基因表達調控的重要環節之一，負責執行這一過程的是細胞核內一個巨大且高度動態變化的分子機器——剪接體（spliceosome）。從1977年首次發現RNA剪接至本世紀初，科學家們通過免疫沉澱、基因敲除、交聯質譜、建立體外剪接反應系統等研究手段，初步建立起剪接體的組裝與解聚的發生過程，以及蛋白與蛋白、蛋白與核酸之間的相互作用、相互調控等複雜的RNA剪接調控網絡。

圖1.  RNA剪接示意圖。圖片來源: Shi Y. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2017.

RNA剪接的本質是兩步轉酯反應，在剪接反應過程中，多種蛋白質-核酸複合物及剪接因子按照高度精確的順序發生結合和解聚，依次形成預組裝複合物U4/U6.U5 Tri-snRNP（U4/U6.U5三小核核糖核蛋白複合物）以及至少7個狀態的剪接體B、B^act、B*、C、C*、P以及ILS複合物（圖1）。

但由於剪接體組成蛋白、核酸種類多，分子量大，並具有多種動態結構，該領域進展一直比較緩慢，獲得剪接體的高解析度三維結構更是世界公認的難題。2015年，施一公研究組率先突破，在世界上首次報導了裂殖酵母剪接體3.6埃的高解析度結構，首次展示了剪接體催化中心近原子解析度的結構。這一重大研究成果對RNA剪接機理的研究產生革命性影響。自2015年第一個剪接體結構發表以後，施一公研究組相繼解析了5個不同狀態剪接體複合物的高解析度結構，分別是釀酒酵母3.8埃的預組裝複合物U4/U6.U5 Tri-snRNP、3.5埃的激活狀態複合物B^act complex、3.4埃的第一步催化反應後複合物C complex、4.0埃的第二步催化激活狀態下的C* complex，以及3.5埃的內含子套索剪接體ILS complex的結構。這些已解析的剪接體基本覆蓋了整個RNA剪接循環，從分子層面解釋了剪接體如何組裝、如何激活、第一步轉酯反應如何發生，及完成RNA剪接反應後的剪接體如何解聚等工作機理。但是第二步轉酯反應如何被調控並發生，則需要捕獲一個最為關鍵的剪接體狀態——催化後剪接體，即P複合物。

不同於上述已解析的多個狀態的剪接體，P複合物具有更高度的動態性與瞬時性，在正常生理狀態下極難捕獲。在最新發表的論文中，施一公研究組進一步探索並優化了蛋白提純方案，通過在釀酒酵母中表達關鍵蛋白的失活突變體導致剪接體無法釋放成熟的mRNA，從而獲得了穩定的、性質良好的P複合物樣品。隨後利用單顆粒冷凍電鏡技術重構出了總體解析度為3.6埃的高解析度冷凍電鏡結構，並搭建了原子模型（圖2）。

 

圖2. 釀酒酵母催化後剪接體的三維結構。

這一結構首次展示了RNA剪接兩步轉酯反應完成後剪接體的整體結構以及內部蛋白質、核酸組分的組裝情況，其中可以清晰的看到原本被內含子隔開的兩個外顯子已經共價連接形成成熟的mRNA並且被U5 snRNA識別固定在剪接體的反應中心。值得一提的是，在這個結構中，第一次觀察到了mRNA前驅體中3』剪接位點AG被分支點A和5』剪接位點的第一個核苷酸G通過非經典的鹼基互補配對共同識別的機制，這兩個核苷酸AG還進一步被5』剪接位點的G和U6 snRNA通過鹼基堆積力固定。因此，該結構的解析，首次展示了3』剪接位點被識別、關鍵蛋白Prp22參與成熟的mRNA釋放等重要的結構信息，為領域內對第二步轉酯反應發生時3』剪接位點如何被識別的長達數年的猜想與爭論提供了最有效的結構證據。

圖3. 施一公研究組解析的酵母剪接體結構匯總。

清華大學施一公研究組一直致力於捕捉RNA剪接過程中處於不同動態變化的剪接體結構，從而從分子層面闡釋RNA剪接的工作機理。目前，施一公研究組在酵母中已一共解析了7個不同狀態的剪接體高分辨的三維結構（如圖3），從預組裝到被激活、從發生兩步轉酯反應到剪接體的解聚，這7個狀態的剪接體覆蓋了整個剪接通路，首次將剪接體介導RNA剪接的過程串聯起來，為理解RNA剪接的分子機理提供了清晰、全面的結構信息。

清華大學生命學院施一公教授為本文的通訊作者；清華大學生命學院三年級博士研究生白蕊、生命學院博士後閆創業以及醫學院五年級博士研究生萬蕊雪為該文的共同第一作者；清華大學冷凍電鏡平臺的雷建林博士為冷凍電鏡數據收集提供了幫助。電鏡數據採集於清華大學冷凍電鏡平臺，計算工作得到清華大學高性能計算平臺、國家蛋白質設施實驗技術中心(北京)的支持。本工作獲得了北京結構生物學高精尖創新中心及國家自然科學基金委的經費支持。

原文連結：

http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)31264-3

相關論文連結：

http://science.sciencemag.org/content/early/2016/01/06/science.aad6466

http://science.sciencemag.org/content/early/2015/08/19/science.aac8159

http://science.sciencemag.org/content/early/2015/08/19/science.aac7629

http://science.sciencemag.org/content/early/2016/07/20/science.aag0291

http://science.sciencemag.org/content/early/2016/07/20/science.aag2235

http://science.sciencemag.org/content/early/2016/12/14/science.aak9979.full

http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)30954-6

供稿：生命學院 編輯：悸寔 華山 田心