基因敲除細胞系技術-源井生物

細胞系是由具有無限分裂能力的轉化細胞群組成。這通常來源於實驗室患者或動物的細胞系的致瘤起因。細胞系在研究中可能是無價的，整個醫學領域都異常的重視。它們通常堅固並且需要相對簡單的條件，從而進行組織培養。通過這種方式，這些類型的細胞最適合用於概念驗證工作的基因敲除細胞系技術（例如生物列印設備和技術的開發和初始實施）。但是，儘管細胞系確實保留了其來源細胞類型的某些正常功能，但通常會大大降低其功能。

含有穀氨醯胺合成酶（GS）基因敲除的細胞系和使用該基因敲除的HEK293細胞系生產靶蛋白的方法

本發明涉及從轉基因HEK293（人胚腎293）細胞系中敲除的新型GS（穀氨醯胺合成酶）基因和使用該轉基因HEK293細胞系製備靶蛋白的方法。特別地，本發明人消除了HEK293細胞中GS的表達，以克服由GS的過表達引起的細胞系選擇障礙，從而通過GS / MSX系統產生靶蛋白，從而提高了效率。因此，高產量靶蛋白的細胞系選擇將增加，因此所選細胞系的蛋白產量顯上升，這表明穩轉細胞系的基因編輯技術可以有效地用於生產靶蛋白。

轉基因細胞系網狀細胞可以剖析宿主瘧疾入侵的需求

這種無核細胞的遺傳難治性阻礙了對宿主紅細胞蛋白在瘧疾感染中的作用進行了研究。而在研究人員的報告中，從體外分離出的永生紅細胞系（BEL-A）分化出的網狀細胞支持惡性瘧原蟲的成功入侵和細胞內發育。利用CRISPR介導的基因敲除和隨後的互補作用，研究人員驗證了紅細胞受體西那平在惡性瘧原蟲侵襲中起到的重要作用，並通過受體的重新表達證明了對侵襲性細胞系基因編輯進行挽救。網織紅細胞的成功侵襲補充了截短的突變體，消除了侵襲過程中basigin胞質域的功能作用。相反，據報導，參與侵襲並與basigin相互作用的親環蛋白B的敲除不影響網織細胞的侵襲敏感性。這些數據建立了永生紅細胞來源的網織紅細胞作為強大的模型系統的用途，以探索有關惡性瘧原蟲入侵的宿主受體需求的假設。研究人員表明，來自永生紅細胞的網狀細胞支持惡性瘧原蟲的侵襲和發展，並使用CRISPR介導的基因敲除和侵襲受體的互補來證明該模型系統在瘧疾侵襲研究中的實用性。

EndoC-βH1細胞系中的CRISPR/Cas9基因組編輯管道，用於研究與細胞功能有關的基因

2型糖尿病（T2D）是全球性的大流行病，具有很強的遺傳成分，但是影響疾病風險的大多數致病基因都為未知的。現在，很清楚，胰島β細胞是T2D發病機制的中心。迄今為止，用於研究T2D風險基因的體外基因敲除（KO）模型一直集中在齧齒動物β細胞上。但是，齧齒動物和人的細胞系之間存在重要的結構和功能差異。考慮到這一點，研究人員已經開發出了強大的管道，可以在真實的人類細胞系中（EndoC-βH1）中創建穩定的CRISPR/Cas9 KO。 KO流程包括雙重慢病毒sgRNA策略，研究人員針對三個基因（INS，IDE，PAM）進行了概念驗證。研究人員實現了所有靶基因mRNA水平的顯著降低和蛋白質的完全消耗。使用這種雙重sgRNA策略，可以從目標基因中切割出多達94 kb的DNA，每個sgRNA的編輯效率都超過了87.5％。脫靶序列沒有特別的敲除和編輯。最重要的是，管道有不影響細胞的葡萄糖反應性胰島素分泌。有趣的是，使用siRNA介導的敲除（KD）方法比較NEUROD1和SLC30A8的KO細胞系表現出表型差異。 NEUROD1-KO細胞不活躍，並顯示出較高的內質網應激和凋亡標記。然而，NEUROD1-KD的促凋亡轉錄因子CHOP和基因表達譜僅適度升高，增幅為34％，表明慢性ER應激，而沒有細胞死亡的證據。另一方面，與siRNA沉默相反，SLC30A8-KO細胞顯示出K ATP通道基因表達沒有降低。總體而言，這種在人的細胞系EndoC-βH1中有效創建穩定KO的策略將使人們更好地了解與編輯細胞功能異常有關的基因，與其潛在的功能機制和T2D發病原理。

由Ubigene開發的CRISPR-U™（基於CRISPR / Cas9技術）在雙鏈斷裂方面比普通CRISPR / Cas9更有效，而CRISPR-U™可以大大提高同源重組的效率，輕鬆實現敲除（KO）），體外和體內的點突變（PM）和敲入（KI）。藉助CRISPR-U，Ubigene已成功編輯了100多個細胞系上的基因。

Reference

Gyun Min Lee, Da Young Yu, Soo Min Noh.Cell line containing a knockout of the glutamine synthetase (GS) gene and a method of producing target proteins using a GS knockout HEK293 cell line.2016.US Patent

Satchwell T J, Wright K E, Haydnsmith K L, et al. Genetic manipulation of cell line derived reticulocytes enables dissection of host malaria invasion requirements[J]. Nature Communications, 2019, 10(1): 3806-3806.

Grotz AK, Abaitua F, Navarro-Guerrero E, Hastoy B, Ebner D, Gloyn AL. A CRISPR/Cas9 genome editing pipeline in the EndoC-βH1 cell line to study genes implicated in beta cell function. Wellcome Open Res. 2020;4:150. Published 2020 Apr 29.

doi:10.12688/wellcomeopenres.15447.2.

基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調控記錄的能力，而且具有多種優勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統。首先，它在穀氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達可以快速產生重組蛋白。第三，可用於穩定的重組蛋白生產。一些研究人員利用基因細胞敲除切割效率系統產生基因編輯細胞系，對GLUL基因組位點進行靶向測序，產生了EPO的穩轉細胞系，並發現重組促紅細胞生成素在人體內穩定表達的機制。

Ubigene根據科研需求，結合靶基因的情況進行基因穩轉敲除方案設計

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設在外顯子2兩端的內含子中，敲除外顯子編碼鹼基數為非3倍數，敲除後可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設在外顯子上，缺失的鹼基數為非3倍數，敲除後可發生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達到大片段敲除的效果。

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