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科學家在做細胞基因敲除之前都會先做基因敲低，但是由於shRNA的技術本身的限制無法獲得基因功能完全缺失的細胞（一般shRNA大概是70% Knockdown），甚至經常會出現shRNA敲低了，但是細胞WB效果不好；同時Knockout使用移碼敲除的方式也會出現WB敲除不乾淨的問題！所以，最後還是會選擇做細胞基因敲除（大片段敲除）的方法來做基因的蛋白功能的徹底敲除。如何才能高效做細胞基因大片段敲除呢？我們下面從周期和方法選擇進行說明：
基因敲除細胞系的流程如下：
1、選擇敲除的基因位置和Cas9X敲除載體構建：（2周）
我們一般選擇1-10kb片段大小做敲除，這個大小的效率比較合適；一般選擇能夠非三倍數的外顯子做敲除更好，如果沒有問題也不大，可以選擇大的片段做就可以了；
然後就可以設計併合成Dual-gRNA，通過PCR的方式將目的gRNA構建入敲除載體中，經過測序後就可以用於後續的實驗；
2、細胞的準備與轉染：（2周）
Cas9X一般使用電轉的方式構建細胞敲除細胞株：一般構建敲除細胞株可以使用電轉或者病毒或者脂質體的轉染方式；
A、脂質體的參考各個公司的說明書；
B、如果使用電轉的效率會高1倍左右；
C、使用Cas9X專有的VIRUS-Free技術的效率與使用病毒的效果基本相當（但是周期縮短一半）；
電轉後經過3天的藥物篩選，然後就可以做單克隆了：
A、極限稀釋法：其實很簡單的啊，就是把你要分離單克隆的細胞收集之後做梯度稀釋，稀釋到一定的倍數之後，培養，擴出來的就是單克隆了。【這種方法工作量極大，而且克隆很多都是混雜的狀態】
B、克隆環法：克隆環是篩選單克隆細胞的一個簡單易行的方法，用克隆環可以有效地從培養板或者培養皿等培養耗材獲得單克隆細胞。【這種方法極其低效】
C、ClonePlus技術：是Cas9X技術平臺研發的專有高效細胞敲除技術，主要通過高通量電轉系統和高通量的克隆分選技術結合，獲得基因編輯的單細胞，其克隆形成率可以達98%，就算是克隆形成率低的細胞株也能獲得敲除單克隆。【7-10天可以完成絕大部分的細胞的單克隆工作】
3、PCR鑑定與擴增：（1周）
將ClonePlus技術獲得的單克隆在96孔中傳代，並將細胞進行PCR鑑定，由於Cas9X使用大片段敲除，可以直接進行PCR鑑定，無需複雜的測序和讀圖鑑定過程；所以一般2天完成鑑定過程，然後就可以將目的克隆細胞直徑進行直接擴增，交付下遊做RT-PCR檢測，保證其mRNA的完全被敲除。
而且，整個快速服務過程我們還使用了：
PCR-Direct技術，可以將少量的細胞直接進行PCR鑑定，無需提取【PCR-Direct技術是針對各類生物樣品組織的直接PCR技術。該技術條件下，無需對核酸進行分離提取，直接以組織樣本為對象，加入目標基因引物進行PCR反應，而且樣品量極少。】
RT-Shipper技術，細胞可以無需凍存直接擴增後在室溫下交付給客戶，可以按照客戶的需要擴增克隆細胞，從10^6~10^8都可以輕鬆郵寄，滿足客戶獲得細胞就可以直接檢測的需求。【可以滿足從幹細胞到各種腫瘤細胞的需求】
ClonePlus技術是整個加速的核心，其中可以加速很多懸浮細胞的擴增時間周期：K562，THP-1等均非常適合。下圖是ClonePlus技術測試的所有的腫瘤細胞的類型供各位參考：【持續公布測試數據】