科學家如何操縱基因表達？(上)

基因的敲低、敲除和敲入

為了研究某個基因的功能，科學家經常需要操縱某個基因的表達。常見的方法有兩種：降低該基因表達，或完全敲除該基因。

這兩種方式操縱的位置，位於遺傳信息流的不同地點。

DNA雙螺旋之父克裡克，早在上世紀就提出了關於遺傳信息的中心法則。中心法則告訴我們，DNA首先轉錄成信使RNA(mRNA)，然後mRNA再翻譯成蛋白質。這是遺傳信息流動的標準路徑。

中心法則

降低基因表達的操作通常在這一路徑的mRNA上，即通過下調mRNA的水平，使蛋白質在細胞內的表達水平下降。這種方法不影響DNA，mRNA依舊可以被轉錄出來。雖然大部分mRNA會受影響，但仍有漏網的mRNA被翻譯成蛋白質。因此，科學家稱此類技術為Knock-down，敲低，只是下調蛋白表達，並不能完全消除蛋白。

與之相對的是基因敲除。基因敲除(knock out)的操縱位置則位於遺傳信息流的起始點——DNA。通過突變等手段，基因敲除技術使目標基因無法表達或表達不出正常的蛋白。

對應於基因敲除，還有一種基因操縱方式叫敲入。顧名思義，敲入是指將一個基因片段插進細胞基因組。

敲除和敲入都是對基因密碼的刪減和添加，因此稱為基因編輯技術。

相對於敲除、敲入的基因編輯，敲減則是對mRNA的操作，即通過下調mRNA的水平，使蛋白質在細胞內的表達水平下降。

敲減基因有多種方法：siRNA，shRNA，CRISPR-CasRx等。

而敲除基因的方式最常見的是CRISPR-Cas9技術。

我們一起來了解下這些神秘高深的生命科學技術。

小幹擾RNA敲低技術

小幹擾RNA（small interfering RNA，siRNA）一般是20-25bp的雙鏈短RNA鏈，它可以通過降解mRNA，幹擾翻譯過程，從而降低蛋白質的表達水平。

通過脂質體轉染、電轉等方式，直接將siRNA導入細胞後，細胞內的一種特殊蛋白複合體（RISC複合體）能夠和siRNA結合，解開其雙鏈，使雙鏈RNA變為單鏈RNA。

打開的單鏈RNA能夠和mRNA上的互補序列結合，然後RISC複合體會切斷與其互補的mRNA序列。完成這一系列操作後，RISC-siRNA複合體帶著單鏈的siRNA，會從切斷的mRNA上解脫，再去結合、降解其他的mRNA。

基因的mRNA被切斷以後，就不能進行後續的蛋白翻譯，無法合成蛋白質。因此，蛋白質的表達水平下降，基因的功能被沉默掉。

siRNA敲低降解mRNA過程

除了直接導入siRNA到細胞內，還可以導入siRNA的前體——長雙鏈RNA進入細胞。長雙鏈RNA進入細胞後，會被細胞內部的Dicer酶切割，生成siRNA，進而敲減相應的基因。

除長雙鏈RNA外，短髮卡RNA（shRNA）也可以作為siRNA的前體。shRNA被切割成siRNA後，也可以敲減目標基因。

siRNA在細胞內屬於消耗品，消耗完之後，mRNA的表達便不再被抑制，蛋白水平也會恢復。因此，siRNA的敲減是一種瞬時的作用。

短髮卡RNA敲低技術

短髮卡RNA（short hairpin/ small hairpin RNA， shRNA）是一種短的頸環結構，類似發卡。

shRNA形似發卡

shRNA一般通過質粒病毒等載體導入細胞內。以病毒載體為例，導入的shRNA是以DNA形式存在。在細胞核內，載體上相應的序列會轉錄出pri-miRNA，這是一種具有頸環結構的小RNA（microRNA, miRNA）。細胞內的Drosha酶會修剪pri-miRNA的兩端序列，使其變成小RNA，這正是shRNA的前體（pre-shRNA）。pre-shRNA會走出細胞核，到達細胞質。進入細胞質以後，pre-shRNA便形成了成熟的shRNA。

shRNA在Dicer酶作用下，環狀結構被切掉，只剩下發卡的「莖」，這是核心的siRNA序列。siRNA會以上述同樣的機制，發揮基因敲減的作用。

shRNA發揮作用全過程

shRNA需要經細胞內的酶進行切割，才能轉變成siRNA而發揮作用。與siRNA的瞬態效果相比，shRNA可以通過病毒載體整合到基因組，因此可以穩定表達，長久持續地發揮作用。

近幾年大熱的CRISPR技術，既可以更高效地敲減基因，又可以敲除、敲入基因，是最有潛力運用到臨床的基因編輯技術。CRISPR技術的發明人是麻省理工的華人科學家張峰，是諾貝爾獎的熱門候選人，難怪連王力宏都為其站臺。

張峰和王力宏

下篇文章，我將詳細講解CRISPR基因編輯技術。