張博、杜久林分別獨立建立高效條件性基因敲除與基因標記技術

2021-01-20 騰訊網

近年來，隨著以CRISPR/Cas系統為基礎的基因組定點修飾技術的飛速發展，製備indel等簡單突變體的應用已經較為成熟，但是條件性/組織特異性基因敲除、基因標記等複雜的基因組修飾往往需要進行靶向敲入（knock-in，KI），而這類應用仍然存在效率低、周期長等問題，從而嚴重製約了基因功能的深入與精細研究，以及CRISPR/Cas技術在疾病模型構建與基因治療等的應用【1，2】。同時，作為重要的模式動物，斑馬魚的條件性基因敲除技術仍不成熟，極大地限制了其基因功能研究。最近，我國學者在斑馬魚條件性基因敲除技術上取得了重大進展。

10月30日，北京大學張博團隊在eLife雜誌發表了題為「One-step efficient generation of dual-function conditional knockout and geno-tagging alleles in zebrafish」的論文，通過設計正-負雙元件供體（dual-cassette donor）靶向插入策略和改進實驗方法，在斑馬魚中利用非同源末端連接（NHEJ）途徑在靶基因的內含子中通過一次插入同時引入兩個loxP序列以及螢光蛋白報告基因，從而快速、高效地對目的基因實現了雙功能遺傳修飾，所獲KI魚系既可進行條件性/組織特異性敲除，又可達到基因/等位基因表達的活體標記與細胞示蹤效果。

圖1-A利用改進的正-負供體構建靶向tbx5a的雙功能螢光轉換KI魚系

該論文設計的正-負供體（positive-negative donor，PoNe donor）主要包含正元件（Po-cassette）和負元件（Ne-cassette）兩個部分。正元件帶有靶基因中靶點之後的第一個剪接位點和隨後的所有編碼序列，用來還原/維持靶基因的正常表達；同時通過2A肽段連接in-frame的螢光蛋白報告基因；正元件兩側分別引入一個同向的loxP序列。負元件緊隨正元件和loxP之後，由串聯的轉錄終止信號以及含有提前終止密碼子的突變型外顯子共同組成，以便有效地終止靶基因的轉錄和翻譯。當正-負供體由CRISPR/Cas系統介導定點整合進入靶基因後，在正常情況下正元件表達，模擬野生型內源靶基因的表達和功能，負元件則不起作用；此時的KI魚系表現為基因標記的效果。如果引入Cre重組酶，則正元件會被特異刪除（螢光報告基因的表達隨之消失），使負元件得以表達，從而造成靶基因功能失活，這樣就可以實現對靶基因的條件性敲除。上述策略在斑馬魚心臟發育重要調控基因tbx5a和kctd10中得到了驗證。

圖1-B-C

更進一步，該論文提出了基因型標記（geno-tagging）或稱等位基因標記（allele-tagging）的概念，即利用不同的螢光蛋白報告基因對不同的等位基因（「野生型」和「突變型」）分別進行標記，進而可通過螢光信號的組合區分不同基因型的細胞（純合「野生型」、雜合子和純合「突變型」）。為了實現這一效果，該論文對上述正-負供體進行了升級改進，在負元件中引入跟正元件不同的第二個螢光蛋白報告基因，建立了活體基因型標記技術。上述策略在斑馬魚tbx5a和神經嵴發育重要調控基因sox10中證明了可行性，成功實現了條件性基因敲除和基因標記的螢光轉換（圖1）。

圖1-D

12月20日，中科院神經所杜久林課題組在Science China Life Sciences發表了題為「One-step Generation of Zebrafish Carrying a Conditional Knockout-Knockin Visible Switch via CRISPR/Cas9-Mediated Intron Targeting」的研究論文，建立了新的斑馬魚組織特異性基因敲除技術zCKOIS（zebrafish Conditional KnockOut-knockIn Switch），通過在基因內含子中進行Cas9定點操作，利用NHEJ的高效性，在基因內插入含有紅色螢光蛋白指示的反向敲除標記序列和綠色螢光蛋白指示的正向敲入標記序列的供體質粒，結合組織特異Cre的表達，實現了可視化的組織細胞特異性的基因敲除。

圖2構建hey2-zCKOIS斑馬魚品系並在血管內皮細胞特異性敲除hey2基因

與張博組論文不同的是，杜久林組論文巧妙地將含有兩對突變型的LoxP/LoxP5171序列的元件（圖2中的loxP5171/loxP-TagRFP-loxP5171/loxP序列）反向構建到含有正向敲入序列（圖2中的E5-EGFP序列）的供體質粒中，並通過NHEJ的方式插入到hey2基因的內含子中，建立hey2基因的zCKIOS品系（Ki(hey2-zCKOIS）)。無Cre蛋白表達時，hey2基因的結構和功能完整，實現了綠色螢光在hey2基因中的敲入，從而顯示了該基因的內源表達特徵。此時實現了利用zCKOIS進行綠色螢光標記的敲入；然而，在啟動Cre蛋白表達後，兩對LoxP位點的DNA序列元件被Cre反轉，反轉後的序列通過剪接受體和hey2基因的前一個外顯子（E4）結合，導致其缺失含有重要功能結構域的最後一個外顯子(E5)，破壞了該基因的結構與功能，並且將被破壞的基因加上了紅色螢光標籤。因此，結合特異性的Cre表達，實現了利用zCKOIS進行特異性基因敲除。利用該技術，能夠使得科研人員在螢光顯微鏡下直接通過顏色看到並判斷該基因在細胞中是否被敲除，免去了通過處死樣本進行PCR擴增測序後才能鑑定其基因型的繁瑣操作。

上述研究成果，實現了一步法產生雙色標記的敲入及條件性基因敲除品系，填補了一直無法高效地在斑馬魚上進行基因特異性敲除的空白，為斑馬魚基因功能的研究提供了重要的技術手段。

簡單來說，上述兩篇文章都是通過設計正-負供體實現還原內源基因表達和破壞內源基因表達的功能。不同的是，張博團隊的正篩選標記被一對正向放置的loxP包圍，Cre靶向後，導致正篩選標記丟失並破壞內源基因，表達負篩選標記；而杜久林組的負篩選標記被一對反向放置的loxP包圍，Cre靶向後，導致負篩選標記顛倒，從而表達負篩選標記並破壞內源基因（圖3）。

圖3斑馬魚條件性基因敲除技術示意圖

發表於eLife的論文，由北京大學李文淵博士、博士生張亞鴿和韓冰舟同學為該論文的並列第一作者，張博教授為通訊作者。該工作得到了國家重點研發計劃、973項目、國家自然科學基金、北京大學生命科學學院啟東產業創新基金等經費的大力支持。該項工作已申報專利。

發表於Science China - Life Science的論文，由中科院神經所李佳副研究員，博士生李紅羽和顧珊燁博士為該研究論文的並列第一作者，博士研究生訾化星亦作出貢獻，李佳副研究員和杜久林研究員為通訊作者。該工作得到了國家自然科學基金青年項目，上海市科技重大專項，中國科學院前沿科學重點研究項目、中國科學院戰略性先導科技專項，中科院國際合作局國際合作項目，中國萬人計劃和上海市優秀學術帶頭人等項目的支持。該項工作也已申報專利。

據悉，在杜久林組論文投稿過程中，張博組的論文正好在線發表。因此，兩個實驗室可以說是各自獨立建立了斑馬魚中基於內含子敲入的基因標記和條件性基因敲除技術。

https://elifesciences.org/articles/48081

參考文獻：

1. Su, D., et al., One-step generation of mice carrying aconditional allele together with an HA-tag insertion for the delta opioidreceptor. Sci Rep, 2017. 7: p. 44476.

2. Yu, Y. and A. Bradley, Engineering chromosomal rearrangements inmice. Nat Rev Genet, 2001. 2(10): p. 780-90.

相關焦點

  • 新研究挑戰用於構建條件性基因敲除小鼠的CRISPR方法
    2018年10月6日/生物谷BIOON/---在一項新的研究中，一個由全球17個實驗室組成的聯盟提供的結果與一項高度引用的研究[1]---它描述了一種利用CRISPR構建條件性基因敲除小鼠的技術---相矛盾。這項新的研究表明與那項原始的研究[1]相比，這種技術的效率要低得多。
  • 小鼠研究院丨層層解析條件性基因敲除的「時空開關」—— Cre-loxP系統
    我們之前分享了諾獎級CRISPR技術在基因編輯動物中的應用，其中基因敲除小鼠是我們研究基因功能必不可少的利器，主要分為全身性基因敲除和條件性基因敲除。然而，全身性基因敲除的小鼠存在著無法忽視的缺陷，例如：不能特異性地研究特定基因在特定組織內（及特定的時間）的功能；全身性基因敲除小鼠有時因某些基因對胚胎發育的影響而無法正常分娩；或因出生後嚴重的生理缺陷而過早死亡；或不能產生後代而不能獲得純合子動物模型。因此，條件性基因敲除小鼠雖然有周期長、費用高、需要配合特定工具鼠使用等劣勢，但仍獲得了越來越多的選擇與喜愛。
  • Development:陳永龍等在熱帶爪蛙中建立了高效基因敲除技術
    中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院陳永龍博士的研究團隊成功利用CRISPR/Cas9系統在熱帶爪蛙中獲得了高效的靶向基因破壞，該研究成果Efficient RNA/Cas9-mediated genome editing in Xenopus tropicalis 於1月8日在線發表在DEVELOPMENT上。
  • 基因敲除構巢麴黴的研究-源井生物
    CRISPR在構巢麴黴中高效無標記基因靶向中的應用特定Cas9/sgRNA介導的DNA雙鏈斷裂（DSB）的存活取決於向NHEJ DNA修復途徑中添加非同源末端。我們利用這一觀察結果開發了TAPE工具，以評估構巢麴黴原型間隔物的效率。
  • 《鼠年說鼠》第十四期:CRISPR/Cas9條件性基因敲除鼠如何鑑定?
    基因工程小鼠基因型PCR鑑定的基本原則是利用基因工程小鼠基因組與野生型小鼠基因組的序列差異，以小鼠基因組DNA為模板進行PCR，並以凝膠電泳比對比不同基因型特異產物的大小，根據條帶大小來區分小鼠的不同基因型。上期我們講述了CRISPR/Cas9完全性基因敲除鼠的鑑定，今天我們就開始學習CRISPR/Cas9條件性基因敲除鼠的鑑定。
  • 技術專刊:Cre-loxP基因重組技術
    Cre-loxP是一種位點特異的基因重組技術，被廣泛應用於特異位點的基因敲除、基因插入、基因翻轉和基因易位，在真核生物和原核生物中均有廣泛應用
  • 基因敲除細胞系技術-源井生物
    通過這種方式，這些類型的細胞最適合用於概念驗證工作的基因敲除細胞系技術（例如生物列印設備和技術的開發和初始實施）。但是，儘管細胞系確實保留了其來源細胞類型的某些正常功能，但通常會大大降低其功能。相反，據報導，參與侵襲並與basigin相互作用的親環蛋白B的敲除不影響網織細胞的侵襲敏感性。這些數據建立了永生紅細胞來源的網織紅細胞作為強大的模型系統的用途，以探索有關惡性瘧原蟲入侵的宿主受體需求的假設。研究人員表明，來自永生紅細胞的網狀細胞支持惡性瘧原蟲的侵襲和發展，並使用CRISPR介導的基因敲除和侵襲受體的互補來證明該模型系統在瘧疾侵襲研究中的實用性。
  • 基因敲除真菌編輯服務
    從科學上可以看出，基因敲除技術對於抑制真菌滋長非常有用。從內到外的敲除各種動植物的細菌。真菌病原體是影響植物生長的主要疾病原因，導致產量和作物質量顯著下降，並在全球範圍內造成巨大的經濟損失。據估計，大約30％的新興疾病是由真菌引起的，因此需要新的策略來改善其管理。
  • 同源重組基因敲除技術
    還記的一個月前有朋友後臺問能不能寫一篇關於同源重組敲除基因的技術，由於不習慣查看後臺消息所以沒有第一時間回復。
  • 基因敲除大鼠—如何突破技術限制再次發揮在特定領域的研究優勢
    染色體方面，小鼠20對，大鼠和人類分別是21和23對。隨著人們對大鼠胚胎控制能力的增強以及CRISPR/Cas9技術的到來，拓展了大鼠做為實驗模式動物在基礎研究及藥物篩選、臨床前藥物評價的應用範圍。但是，作為最重要的基因條件性表達方案，Cre-LoxP系統中大鼠品種相對小鼠種類上要少了很多，這一點嚴重阻礙了我們對大鼠的應用。
  • 基因敲除大鼠—如何突破技術限制再次發揮在特定領域的研究優勢
    染色體方面，小鼠20對，大鼠和人類分別是21和23對。SD大鼠和C57小鼠是生物醫學研究中（尤其是神經生物學研究）中最常用的大鼠和小鼠代表，最近的研究通過基於基因晶片分析發現在檢測到的10,833個基因中，有4713個基因在大鼠和小鼠的海馬神經元樹突中存在表達差異。
  • 廣州生物院用TALENs基因敲除技術成功培育免疫缺陷性家兔
    中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院賴良學博士和裴端卿博士領導的研究團隊將轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENs）技術應用於兔基因敲除研究，建立了兔基因打靶的高效平臺。並利用該技術平臺成功地將負責T細胞和B細胞重排的重組激活基因（RAG）敲除，建立了世界首例免疫缺陷家兔疾病模型，該成果於7月9日在線發表於國際期刊Cell Research上。
  • Cell Research:裴端卿、賴良學等人利用TALENs基因敲除技術成功...
    中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院賴良學博士和裴端卿博士領導的研究團隊將轉錄激活因子樣效應物核酸酶（TALENs）技術應用於兔基因敲除研究，建立了兔基因打靶的高效平臺。並利用該技術平臺成功地將負責T細胞和B細胞重排的重組激活基因（RAG）敲除，建立了世界首例免疫缺陷家兔疾病模型，該成果於7月9日在線發表於國際期刊Cell Research上。
  • Nat Neuro丨清華姚駿組等利用dCas9/CRISPRi在小鼠腦內實現多基因...
    隨著神經科學的高速發展，單一基因的敲除/敲低逐漸不足以滿足研究者的要求。尤其是對於複雜的多蛋白複合物和多基因神經疾病，多重基因元素失活的條件性組合搭配正日益成為主流需求。然而，逐一構建不同基因的敲除/敲入動物模型再進行雜交，一直受限於低下的製備效率、冗長的製作周期和昂貴的成本費用，成為了實際研究中的主要瓶頸之一。因此，快捷簡單地操作大腦中的基因表達的方法亟需建立。
  • 基因敲除法
    和「基因敲除」類似，RNA幹擾也能作為研究基因功能的絕佳工具。要想研究某個基因對於整個生命體的作用，就必須把該個體所有細胞中存在的該基因全部「敲除」，這可就難了。當年卡佩奇曾經向美國國立衛生研究院（NIH）申請研究基金，把這個方法用於哺乳動物，結果被NIH嚴詞拒絕。但是卡佩奇沒有放棄，他偷偷挪用了自己從別的課題申請到的錢，用來資助這項研究，幾年後他終於證明這個思路是可行的。與此同時，史密斯也獨立地證明了這一點。
  • Crispr基因敲除細胞系系統分析-源井生物
    基因敲除細胞系的前提條件性，是要一種用於消除某些組織（例如肝臟）中特定基因的技術。該技術對於研究個體基因在活生物體中的作用非常廣泛。它與傳統的基因敲除技術不同，因為它在特定的時間針對特定的基因，而不是從一開始就將其清除。而基因敲除技術的使用消除了許多傳統基因敲除的副作用。在傳統的基因敲除中，胚胎可能由於基因突變而死亡，這使科學家無法研究成年的基因細胞。
  • Crispr基因敲除細胞系系統分析-源井生物
    基因敲除細胞系的前提條件性，是要一種用於消除某些組織（例如肝臟）中特定基因的技術。該技術對於研究個體基因在活生物體中的作用非常廣泛。它與傳統的基因敲除技術不同，因為它在特定的時間針對特定的基因，而不是從一開始就將其清除。而基因敲除技術的使用消除了許多傳統基因敲除的副作用。在傳統的基因敲除中，胚胎可能由於基因突變而死亡，這使科學家無法研究成年的基因細胞。然而某些細胞組織即使可以敲除也不能單獨進行研究，因此該細胞在某些組織中必須是無活性的，而在其他組織中必須保持活性。
  • ...Cell Physiol:新方法讓CRISPR/Cas9高效地敲除擬南芥中的靶基因
    2016年12月11日/生物谷BIOON/---在一項新的研究中，來自日本名古屋大學轉化生物分子研究所的兩名生物學家Hiroki Tsutsui和Tetsuya Higashiyama開發出一種新的載體（一種轉運遺傳信息的載體），從而允許高效地和可遺傳地敲除模式植物擬南芥中的靶基因。
  • 熱議的「基因敲除」如何實現，拿錘子敲掉基因？
    這樣理解也是可以的，畢竟這句話已經道出了基因敲除的本質，只是還稍微有點片面而已。 基因敲除的正式定義是這樣的：用人們已經知道其序列的細胞外DNA片段，與目標細胞內的相似基因進行同源重組，結果要麼是重組位置的基因被外來基因代替，要麼是重組位置的基因被沉默。 說簡單點，所謂基因敲除就是使某個序列已知但功能未知的基因失去作用，讓生物失去某些功能，從而研究這個基因的功能的技術。
  • 基因敲除裡氏木黴可改變生物體基因組的遺傳-源井生物
    裡氏木黴（Trichoderma reesei）是一種真菌，是纖維素酶和半纖維素酶的知名高效生產商，因此被酶工業廣泛用於生產其自身的內源酶以及生產異質蛋白。兩年來，許多研究表明，CRISPR/Cas9系統是一種強大的基因組編輯方法，基因敲除可促進多種生物體中基因組的遺傳改變。到目前為止，還沒有關於CRISPR/Cas9系統或其他系統的報導。