《鼠年說鼠》系列文章，每周二更新，專門解答大小鼠鏟屎官們在養鼠過程中經常遇到的繁育與鑑定類的問題，同時向大家徵集問題，任何基因編輯鼠飼養繁殖或鑑定的困惑統統可以丟給小賽，小賽會給您回復或統一在後面的內容為大家做出詳細的解答。
基因工程小鼠基因型PCR鑑定的基本原則是利用基因工程小鼠基因組與野生型小鼠基因組的序列差異，以小鼠基因組DNA為模板進行PCR，並以凝膠電泳比對比不同基因型特異產物的大小，根據條帶大小來區分小鼠的不同基因型。上期我們講述了CRISPR/Cas9完全性基因敲除鼠的鑑定，今天我們就開始學習CRISPR/Cas9條件性基因敲除鼠的鑑定。
一、驗證F1代flox鼠打靶是否正確
1. 引物設計
F1/R1驗證5'arm打靶是否正確，F2/R2驗證3'arm打靶是否正確，F5/R5、F6/R6驗證兩端loxP位點。鑑定為陽性的鼠繼續進行Southern Blot的驗證。
2. 預期片段大小
條帶1的大小為：F1/R1擴增的5'arm端，包括野生型骨架區+同源臂+loxP+部分敲除區域；
條帶2的大小為：F2/R2擴增的3'arm端，包括野生型骨架區+同源臂+loxP+部分敲除區域；
條帶3的大小為：F5/R5擴增的5'arm端，同源臂+loxP+部分敲除區域；
條帶4的大小為：F6/R6擴增的3'arm端，同源臂+loxP+部分敲除區域。
備註：條帶1和條帶2是對同源臂骨架區的驗證，片段一般是2kb以上，擴增難度較大。賽業在交付之前會進行驗證，您無需再進行驗證。
3. 電泳結果
若電泳結果同時有條帶1、條帶2、條帶3、條帶4，則為陽性flox鼠；
若沒有擴增出目的條帶的則為陰性鼠（野生型或其它突變）。
4. 測序
除了PCR鑑定，還需要將產物送測確認。F1/R1擴增產物的測序引物設在靠近loxP位點的5』arm上（圖示中的F3），F2/R2擴增產物的測序引物設在靠近loxP位點的3'arm上（圖示中的F4）。
二、F2代flox鼠的純雜合鑑定
1. 引物設計
交付F1代陽性小鼠已驗證過同源臂打靶的正確性，其自交產生的後代只需通過驗證小於1kb的目的片段即可，一般設計在特異性好的loxP附近。
2. 預期片段大小
條帶1的大小為：F5/R5擴增的5'arm端，同源臂+loxP+部分敲除區域；
條帶2的大小為：F5/R5擴增的5'arm端，野生型；
條帶3的大小為：F6/R6擴增的3'arm端，同源臂+loxP+部分敲除區域；
條帶4的大小為：F6/R6擴增的3'arm端，野生型；
備註：F5/R5、F6/R6兩對引物選取其中一對驗證即可。
3. 結果
若電泳結果只有條帶1或者條帶3，則判斷為陽性純合鼠（-/-）；
若電泳結果只有條帶2或者條帶4，則判斷為野生鼠（+/+）；
若電泳結果有條帶1和條帶2或者條帶3和條帶4，則為陽性雜合鼠（+/-）。
三、鑑定Cre鼠刪除效率
純合或雜合flox鼠與Cre鼠交配的後代需要鑑定刪除效率，驗證是否發生刪除。驗證刪除效率前需要先鑑定Cre基因，若鼠尾為Cre陽性再取特異性組織進行驗證。
1. 引物設計
在5'arm與3'arm上設計引物，位於cKO區域的上/下遊。
2. 預期片段大小
條帶1的大小為：F5/R7擴增的打靶載體片段；
條帶2的大小為：F5/R7擴增的刪除後的片段；
條帶3的大小為：F5/R5擴增的5'arm端,同源臂+loxP+部分敲除區域；
條帶4的大小為：F5/F5擴增的5'arm端,野生型。
註：F5/R7可能會因片段太大或者基因組的提取效果差而擴增不出條帶。
3. 結果
若電泳結果只有條帶2，則判斷為cKO純合子（即2條染色體均發生刪除）；
若電泳結果有條帶2和條帶4，則判斷為cKO雜合子（即1條染色體發生刪除）；
若電泳結果有條帶1或條帶3，則可能是由於Cre刪除效率低，cKO區域沒有發生刪除。
註：電泳結果可能會出現其他刪除不完全的結果，這與Cre鼠的刪除效率有關，也與實驗取材有關，比如刪除是發生在內皮細胞，但是取材不是特別精細，含有其他組織就會影響結果的判斷。
下期內容預告
CRISPR/Cas9條件性基因敲入鼠如何鑑定？