最近「基因編輯嬰兒問世」事件引起了業內強烈的轟動，在該項研究中賀建奎採用了CRISPR-cas9技術對胚胎進行編輯，用5微米、約頭髮二十分之一細的針把Cas9蛋白和特定的引導序列注射到還處於單細胞的受精卵裡，來達到預防HIV病毒的目的。
關於CRISPR-cas9技術，大家應該都不陌生，我們先來了解一下它的原理：
CRISPR系統最早是細菌在長期演化過程中形成的一種降解入侵病毒的DNA或其他外源DNA的免疫防禦：當病毒把自己的基因整合在細菌的DNA上，企圖利用細菌的複製功能來為自己服務的時候，細菌就進化出了CRISPR系統，把病毒基因從自己的染色體上切除，同時將這些信息錄入自己的基因組，當病毒再次入侵時該系統起到識別入侵的作用可再次切除病毒的DNA，清除病毒的外來入侵基因。這與我們人體的免疫過程大致相同。
目前應用最廣泛的是CRISPR-cas9技術： Cas9蛋白含有兩個核酸酶結構域，可以分別切割DNA兩條單鏈。Cas9首先與crRNA及tracrRNA結合成複合物，然後通過PAM序列結合併侵入DNA，形成RNA-DNA複合結構，進而對目的DNA雙鏈進行切割，使DNA雙鏈斷裂。
而關於CRISPR-cas9技術的應用，我們來介紹一篇高分文章，給大家做一下參考：
該文章發表在《Molecular Cell》期刊上，影響因子14.248。
下面一起看下文章的具體內容：
1. 為了建立一套完整的轉錄後調控miRNA生物合成的蛋白質圖譜，研究人員收集了72名人類miRNA的前體，包括轉錄後調控的miRNA。
研究人員採用STAR方法和不同的量化方法，發現不同的細胞類型之間加工中間體的水平可能有很大的差異，miRNA加工的轉錄後調節是一個廣泛且具有細胞類型特異性的現象。
2. 為了確定與72個前miRNAs特異相互作用的調節蛋白，作者採用質譜法，凝膠電泳法等在體外進行了相互作用的研究，發現了180個蛋白質可以與miRNA前體的單個或一個子集有優先或特異的結合。
3. 作者又進行了生物信息測試，結果顯示180個蛋白質中有162個與「RNA結合」相關，另一些則與『RNA處理』或『剪接』有關。
4. 作者選取了一組候選基因檢測其在細胞中的表達，證實了作者在質譜分析中觀察到的結合特異性，之後採用RIP法等多種方法確認了大量的候選蛋白質。
5. 為了識別RBPs所接觸的miRNA髮夾上的序列區域和基序，作者分析了與之結合的miRNA髮夾，還鑑定了一組與特定的pri-miRNA結合的蛋白質。
6. 接下來作者採用了RNAi或CRISPR/CAS技術進行了敲除實驗，作者首先進行了C9ORF114敲除，因為有報導其與與mRNA相互作用，之後在篩選中發現一對高度相似的兩個RBPs PUM 1和PUM 2，敲除它們檢測相關pri-miRNA的表達，結果顯示輕度上調，表明其抑制作用為轉錄後效應；
之後做了另外一個敲除實驗，敲除了ZC3H7A並檢測相關miRNA的表達，結果表明ZC3H7A具有高度的保守性和結合特異性，在miRNA的調節中可能具有冗餘功能，並加以驗證。
7. 作者做實驗確定了ZC3H10和PRI-miR-143之間具有直接特定的相互作用，之後為了闡明其分子機制，進行了功能損失實驗，結果表明其機制不局限於細胞背景，並且對CELF 1和CELF 2也進行了敲除，數據表明，核RBPs CELF 1/2也可能在DROSHA處理水平上起作用。
8. 最後作者又敲除了TRIM 71基因，並利用CRISPR/Cas9技術使TRIM 71突變，經過實驗證明之後發現通過轉錄後調節miRNA水平可以直接影響靶基因的表達。
實驗完成，我們來看作者是如何運用CRISPR技術的：作者篩選出可能調控miRNA成熟的RBP蛋白之後，利用CRISPR技術對RBP進行敲除看其是否對miRNA成熟過程有影響，例如敲除C9ORF114，先設計sgRNA序列，構建轉染載體pX330-gRNA，用lipo3000方法轉染細胞，之後用RT-PCR和WB方法檢測C9ORF114的表達水平。
你學會了嗎？另外，昨日國家自然科學基金委員會發布公開信，譴責了賀建奎副教授「人類胚胎基因編輯嬰兒」的行為，小博認為，科學技術進步固然可以推動人類社會的發展，但是科學倫理建設也會面臨著越來越多的新挑戰，我們應以負責任的態度去踐行科研中的倫理規範！
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