基因編輯技術-CRISPR/Cas9

2021-02-26 XiaLab

CRISPR是存在於細菌中的一種基因組，該類基因組中含有曾經攻擊過該細菌的病毒的基因片段。細菌通過這些基因片段來偵測並抵抗相同病毒的攻擊，並摧毀其DNA。這類基因組是細菌免疫系統的關鍵組成部分。CRISPR/Cas系統全名為成簇的規律間隔的短回文重複序列（Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats/CRISPR-associated proteins），為目前發現存在於多數細菌與絕大多數的古菌中的一種後天免疫系統，以消滅外來的噬菌體或外源質粒，並在自身基因組中留下外來基因片段作為「記憶」為細菌提供了獲得性免疫，這與哺乳動物的二次免疫類似，可以抵抗它們的再次入侵。目前已發現三種不同類型的 CRISPR/Cas系統，分布在40%的已測序細菌和90%的已測序古細菌當中。其中二型CRISPR/Cas設計簡單以及操作容易的特性為最大的優點，可應用在各種不同的模式生物當中。CRISPR/Cas是進行基因編輯的強大工具，可以對基因進行定點的精確編輯。在嚮導RNA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白的參與下，待編輯的細胞基因組DNA將被看作病毒或外源DNA，被精確剪切。但是，CRISPR/Cas9的應用也有一些限制條件。首先，待編輯的區域附近需要存在相對保守的PAM序列。其次，嚮導RNA要與PAM上遊的序列鹼基互補配對。CRISPR/Cas9最基礎的技術應用就是基因敲除。如果在基因的上下遊各設計一條嚮導RNA（嚮導RNA1，嚮導RNA2），將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質粒一同轉入細胞中，嚮導RNA通過鹼基互補配對可以靶向PAM附近的目標序列，Cas9蛋白會使該基因上下遊的DNA雙鏈斷裂。而生物體自身存在著DNA損傷修復的應答機制，會將斷裂上下遊兩端的序列連接起來，從而實現了細胞中目標基因的敲除。如果在此基礎上為細胞引入一個修復的模板質粒（供體DNA分子），這樣細胞就會按照提供的模板在修復過程中引入片段插入或定點突變。這樣就可以實現基因的替換或者突變。對受精卵細胞進行基因編輯，並將其導入代孕母體中，可以實現基因編輯動物模型的構建。隨著研究的深入，CRISPR/Cas技術已經被廣泛的應用。除了基因敲除，基因替換等基礎編輯方式，它還可以被用於基因激活，疾病模型構建，甚至是基因治療。目前，全世界發表了超過 10000份科研論文提到了CRISPR技術。2018年11月，中國科學家賀建奎聲稱，作為一名基因編輯項目的首席研究員，他的團隊在人類胚胎中使用CRISPR-Cas9技術來敲除CCR5基因，有兩個胚胎被成功植入母體，誕生了世界上第一對經過基因編輯的雙胞胎女嬰露露和娜娜，但該項工作存在嚴重風險，忽視了國際倫理規範，被廣泛譴責，包括美國國立健康研究院、中國科學院等各機構聲明不支持在人類胚胎中使用基因編輯技術。

1.什麼是CRISPR/Cas9

2.詳解CRISPR/Cas9基因編輯技術

3.小鼠基因組編輯

通過將Cas9 mRNA和一種或多種單導向RNA ( SgRNA )直接注射到小鼠胚胎中，可以用CRISPR / Cas9產生新的小鼠模型，從而對特定位點產生精確的基因組編輯。

Generating knockout (KO) mouse models using aNon-Homologous End Joining (NHEJ) approach utilizes optimized sgRNAsco-injected with Cas9 mRNA, resulting in mice with frame-shiftinginsertion/deletion (indel) mutations and gene disruption

Generating knock-in (KI) mouse models using a Homology DirectedRepair (HDR) use either a single-stranded oligonucleotide or plasmid donortemplate are co-injected with optimized sgRNAs and Cas9 mRNA.

參考文獻及網站

1.https://www.jax.org/news-and-insights/jax-blog/2016/february/three-crispr-approaches-for-mouse-genome-editing

2. https://www.youtube.com/watch?v=qGTwGOi4PWQ&t=196s

3. https://www.youtube.com/watch?v=9q8AGst7KiY

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    她們「研發了一種基因編輯方法」，重寫了「生命密碼」。這種技術工具名為CRISPR/Cas9。但它到底是什麼？有何潛力？是誰為它奠定了基礎？據埃菲社馬德裡10月7日報導，它是一種生物學工具，能以前所未有的精度來編輯基因組，而且比以前的其他任何方法都更簡便、成本更低。就像文本編輯工具一樣，CRISPR/Cas9能夠通過「剪切和粘貼」脫氧核糖核酸（DNA）序列的機制來編輯基因組。
  • CRISPR-Cas9基因編輯技術簡介
    CRISPR-Cas9是繼ZFN、TALENs等基因編輯技術推出後的第三代基因編輯技術，短短幾年內,CRISPR-Cas9技術風靡全球, 成為現有基因編輯和基因修飾裡面效率最高、最簡便、成本最低、最容易上手的技術之一，成為當今最主流的基因編輯系統。
  • CRISPR/Cas9基因編輯技術專題研討會
    日～23日（21日報到）   北京   北京冠京飯店     報名方式見本文最後一頁基因編輯技術指能夠讓人類對多個物種內的目標基因進行「精確編輯」，實現對特定DNA片段的刪除、插入、定點突變等。與傳統的TALEN和ZFN基因編輯技術相比，CRISPR/Cas9技術自問世以來，以其操作的便捷性，高效的基因編輯能力獲得青睞，成為當下科研工作者的新寵兒。目前該技術已廣泛應用於人、大鼠、小鼠、斑馬魚、果蠅、豬、水稻、小麥和擬南芥等動植物（細胞）以及細菌等微生物的基因組靶向改造，並已在功能基因組研究、疾病防治、動植物育種、動物疾病模型開發、基因治療等領域展現出巨大的應用前景。