上一回，我們講述了基因功能缺失(Loss of function)研究中常用的方法：RNAi。這一回，我們來講述可用於Loss of function研究的一種新興方法：CRISPR∕Cas9基因編輯技術。
CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats），是細菌和古細菌為應對病毒和質粒不斷攻擊而演化來的獲得性免疫防禦機制，其主要功能是對抗入侵的病毒及外源DNA。科學家利用CRISPR/Cas系統可以對多種細胞的特定的基因組位點上進行切割，以便插入新的遺傳物質。在需要對目的基因的功能進行破壞，或者要進行目的基因替換時都可以使用CRISPR/Cas系統，可以像編輯文字一樣編輯基因，因此被稱為基因編輯技術。
本技術具有簡便、快捷、精準等優點，於2016年獲得被喻為「豪華諾貝爾獎」的生命科學突破獎。CRISPR/Cas的開發為構建更高效的基因定點修飾技術提供了全新平臺。
在細菌和古菌中，crRNA（CRISPR-derived RNA）通過鹼基配對與tracrRNA（trans-activating RNA）結合形成雙鏈RNA，此tracrRNA/crRNA二元複合體指導Cas9蛋白在crRNA引導序列的靶定位點剪切雙鏈DNA，從而達到對基因組DNA進行修飾的目的。
科學家們設計一段小嚮導RNA(small guide RNA, sgRNA)，將這段sgRNA導入細胞中。CRISPR靶向特異性是由兩部分決定的，一部分是此sgRNA和靶DNA之間的鹼基配對，另一部分是Cas9蛋白和一個短DNA序列，這個短的DNA序列通常在靶DNA的3'末端發現，被稱為protospacer adjacent motif（PAM）。
sgRNA與靶DNA結合，招募Cas9內切酶形成複合物，Cas9內切酶則切割，斷裂DNA雙鏈。而當真核細胞識別到的DNA雙鏈斷裂後，通常啟動兩種途徑進行DNA修復，分別為非同源末端結合（non-homologous end joining，NHEJ）和同源介導的雙鏈DNA修復（Homology directed repair，HDR）。NHEJ機制是細胞體內DNA修復最活躍的一種方式，直接將雙鏈斷裂末端的ssDNA拉近，再藉助DNA連接酶等相關酶將斷裂的ssDNA重新接合。在接合的過程中很容易造成鹼基缺失或者插入，從而造成移碼突變（frameshift mutations），最終導致該基因的開放閱讀框（open reading frame）發生改變，蛋白質無法翻譯或者失去功能，達到了基因敲除（Knock-out）的目的。
CRISPR/Cas9原理
最近，科學家們又發現了CRISPR/Cas9切割DNA後修復的另一影響因素：Fanconi anemia（FA）通路[1]。此通路涉及的關鍵基因，與一種罕見貧血症──Fanconi anemia相關，由此得名。在人細胞中，CRISPR/Cas9切割DNA後，如有外源單鏈DNA(如合成的oligo dT)模板，則會發生單鏈模板修復(single-strand template repair, SSTR)，這個過程需要FA通路的眾多分子參與。其中，FANCD2蛋白在CRISPR/Cas9產生的雙鏈斷裂位點上富集。科學家們猜測，在CRISPR/Cas9切割DNA後修復中，FA通路起到「交通燈」的作用：當FA通路不活躍時，修復將導向「無模板」方向，發生NHEJ；當FA通路活躍時，修復將導向「有模板」的方向，發生HDR或SSTR。
在CRISPR/Cas9切割DNA後修復中，FA通路的「交通燈」的作用
科學家們還有一種利用CRISPR系統進行基因敲降（Knock-down）的方法：將體系裡的Cas9突變成dCas9（dead Cas9），它沒有切割DNA活性。在目標基因啟動子區域或者增強子區設計sgRNA，引導dCas9蛋白靶向結合該基因的啟動子區域的DNA。則該位置被dCas9「佔據」，基因轉錄被抑制。還可將轉錄抑制肽KRAB repressor融合的dCas9蛋白的C端，使轉錄抑制更強化。這種技術稱作CRISPR interferance(CRISPRi)。在人細胞中，CRISPRi的轉錄抑制效率可高達90%或以上。
CRISPRi原理
今年8月，關於CRISPR∕Cas技術，德克薩斯大學奧斯汀分校的科學家們又有一則新的發現：CRISPR基因編輯系統中第一個且應用最普遍的Cas9酶，在效力和精確度低於另一種應用較少的Cas12a酶。相關研究成果於8月2日發表在Cell子刊《Molecular cell》上[2]。9月，又有一項新的發現：CRISPR/Cas技術有直接編輯大量體細胞基因組的能力！將帶有CRISPR/Cas9的腺病毒注射進杜氏肌營養不良症小狗的一處骨骼肌中。6周後，取注射過腺病毒的肌肉組織進行檢測。對肌肉組織的進行檢測發現，正常功能的Dstrophin蛋白表達量達到了正常小狗肌肉組織的60%，而未注射得病小狗的只有2%，恢復非常明顯！這展示了其用於基因治療的良好前景。相關研究成果發表在Science上[3]。CRISPR技術現在熱度十足，新發現層出不窮。等待一段時間，一定會沉澱出更好更實用的更新。我們會一直追蹤，並報導給大家。
CRISPR/Cas9基因敲除及CRISPRi，根據原理，其實現方法是在細胞內產生出一段小RNA（sgRNA）及Cas9蛋白質，引導細胞進行基因編輯。
可以在體外合成sgRNA和Cas9蛋白質，一同轉染細胞後，在體內形成複合物，行使其功能。也可以在體外用DNA模板轉錄生成sgRNA，與Cas9蛋白質，一同轉染細胞後，在體內形成複合物，行使其功能。而Cas9，也可以mRNA的形式轉入細胞中再翻譯成蛋白質。
應用最廣泛的，是用質粒轉染細胞。質粒在細胞內轉錄形成sgRNA和Cas9的mRNA，再翻譯形成Cas9蛋白。sgRNA、Cas9蛋白可以用不同的質粒表達，或者用同一質粒表達。 Addgene可以提供這些質粒。為了更快地進行sgRNA的篩選，可以用帶有sgRNA序列的DNA片段（來自PCR）來代替sgRNA的質粒，也可以構建慢病毒載體，感染細胞篩選穩轉株，進行長時間的穩定表達。
實現基因編輯的若干方法
基因編輯目前主要用於基因Knock-out和Knock-down，是基因功能缺失研究的重要方法。目前伯豪生物主要提供兩項服務內容：1、CRISPR/Cas9基因刪除服務；2、CRISPRi 服務，包括載體構建、病毒包裝、細胞感染、病毒滴度，或穩轉株建立、靶基因表達檢測等。
上一回和這一回，分別講述講述了基因功能缺失研究的兩種重要方法，RNAi和CRISPR∕Cas9基因編輯技術。其中CRISPR∕Cas9技術中的CRISPRi，也可以使基因敲降，它與RNAi的區別在何處呢？我們在實驗中該怎樣選擇兩種技術呢？請聽下回分解。
參考文獻：
1 Richardson CD et al. CRISPR-Cas9 genome editing in human cells occurs via the Fanconi anemia pathway. Nat Genet. 2018 Aug;50(8):1132-1139.
2 IsabelStrohkendl et al. Kinetic Basis for DNA Target Specificity of CRISPR-Cas12a.Molecular Cell 2018
3 Leonela Amoasii et al. Gene editingrestores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy.Science 30 Aug 2018
作者：招財貓
往期回顧：
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基因功能研究
From bedside to bench