Cre-loxP是一種位點特異的基因重組技術，被廣泛應用於特異位點的基因敲除、基因插入、基因翻轉和基因易位，在真核生物和原核生物中均有廣泛應用。
Cre-loxP的基本原理
Cre蛋白是一種重組酶，是causes recombination的縮寫，於1981年從P1噬菌體中被發現，屬於λInt酶超基因家族。Cre重組酶基因編碼區序列全長1029bp（EMBL資料庫登錄號為X03453），編碼38kDa蛋白質，Cre重組酶是由343個胺基酸組成的單體蛋白。
LoxP位點，是locusof X-over P1的縮寫，是位於P1噬菌體中的34bp序列，由兩個13bp的反向迴文序列和8bp的中間間隔序列共同組成，間隔序列決定loxP的方向。
Cre重組酶不僅具有催化活性，而且與限制酶相似，能識別特異的DNA序列，即loxP位點，使兩個loxP位點間發生基因重組。Cre重組酶無需藉助任何輔助因子，可作用於多種結構的DNA底物，如線形、環狀甚至超螺旋DNA。
Cre-loxP誘導基因重組的幾種方式
當細胞基因組內存在兩個loxP位點時，一旦有Cre重組酶出現，就會誘導兩個loxP位點間的序列發生重組。首先，Cre重組酶結合到兩個13bp的迴文序列形成二聚體，然後這個二聚體和另外一個loxP位點上的二聚體結合，形成四聚體。LoxP位點是有方向的，形成四聚體的兩個loxP位點是平行的，隨後這兩個loxP位點間的雙鏈DNA被Cre重組酶切掉，然後切口在DNA連接酶的作用下重新連接。重組的結果取決於兩個loxP位點的方向，主要有以下幾種可能：
如果兩個loxP位點位於一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效敲除兩個loxP位點間的序列(圖1A)；
如果兩個loxP位點位於一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導致兩個loxP位點間的序列翻轉(圖1B)；
如果兩個loxP位點分別位於兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre酶能介導兩條DNA鏈的交換或染色體易位(圖1C)。
Cre-loxP系統的優點
在當今世界上，Cre-loxP系統是在神經系統中應用最廣泛的條件性基因敲除工具，主要是因為該系統有如下優點：
圖1. Cre-loxP誘導基因重組的方式，敲除(A)、翻轉(B)、易位(C)
高效性：Cre重組酶與具有loxP位點的DNA片段形成複合物之後，可以提供足夠的能力引發之後的DNA重組過程，重組過程簡約高效；
特異性強：loxP位點是一段含迴文序列結構和中間有間隔的34bp元件，這種結構保證了loxP序列的唯一性，從而保證基因重組的特異性很強；
可應用範圍廣：Cre重組酶是一種比較穩定的蛋白質，可以在生物體不同的組織、不同的生理條件下發揮作用，所以說Cre-loxP系統的可應用範圍非常廣；
可由二型啟動子啟動表達：Cre重組酶的編碼基因可由任何一種二型啟動子驅動，由此保證Cre重組酶在生物體不同的細胞、組織、器官或者在不同的發育階段或不同的勝利條件下表達，從而實現較高的組織和細胞特異性。
Cre-loxP系統的操作方式
1. 轉基因動物依賴的基因重組
一般情況下，科學家們利用Cre-loxP系統進行基因操作時，會採用兩種轉基因動物進行雜交，即一種帶Cre的轉基因動物和一種帶loxP序列的轉基因動物進行交配，使得後代既帶Cre又帶loxP基因，然後Cre重組酶會識別loxP位點，導致基因重組（圖2）。由於Cre基因的表達受上遊啟動子的調控，這樣啟動子的時空特異性就決定了基因重組的時空特異性。雖然該方法可以實現高效、特異的基因重組，但是以下不足限制了用轉基因動物進行基因操作的發展：
動物交配很耗時間：轉基因動物達到實驗室後，首先需要將轉基因動物的數量擴大，然後經過至少2代交配才能拿到基因敲除的小鼠，而交配一代小鼠至少需要2個月時間，所以至少需要半年時間才能拿到基因敲除的小鼠，因此說轉基因動物的交配很耗時間；
區域或者組織特異性不高：因為轉基因小鼠依賴的基因敲除的特異性只能依賴於啟動子的調控，而有些啟動子並不能完全符合科研工作者對於區域或者組織特異性的要求，這樣就會使實驗結果不精確。
2. 病毒依賴的基因重組
由於轉基因動物依賴的基因重組存在以上不足，現在越來越多的科研工作者開始採用比較靈活的方式使用Cre-loxP系統。通過病毒引入Cre或loxP元件，結合一種轉基因小鼠是比較常用的方式（圖3）。相比於轉基因動物依賴的基因重組，病毒依賴的基因重組有以下優點：
更強的區域特異性：由於病毒可以通過局部注射的方式保證區域特異性感染，再加上驅動Cre基因的特異性啟動子，能夠實現更強的區域和細胞特異性的基因重組；
更少的花費：購買轉基因動物的費用一般是比較昂貴的，而且轉基因動物的飼養、基因型鑑定都需要不少的人力、物力，而病毒的製備、保存和注射所花的費用相對來說是比較少的；
更短的實驗周期：由於病毒能非常迅速的起作用，而轉基因小鼠的交配過程特別耗時間，因此採用注射病毒到轉基因小鼠體內的方式，可以大量縮短實驗周期。
圖3. 病毒依賴的基因敲除操作示意圖，注射Cre病毒進loxP轉基因小鼠體內(A)，或者注射loxP病毒到Cre轉基因小鼠體內B)
改造的Cre-loxP系統
經過現代基因工程方法對Cre和loxP元件的改造，Cre-loxP系統實現了更加豐富的條件性重組策略。
對Cre元件的改造：對Cre元件的改造提高了Cre重組酶的活性，並且實現了藥物可誘導性。例如，通過在Cre元件上引入真核細胞核定位序列NLS，Cre重組酶能在低表達豐度下實現重組，這對於一些低豐度的啟動子很重要。另外，在Cre元件的C端接上一段改造過的配體結合結構域LBD，新的融合蛋白Cre-LBD將定位在胞漿內，當人工合成的激素分子結合到Cre-LBD受體後，蛋白構象改變並進入核內，介導基因重組，目前使用最多的是tamoxifen誘導的CreERT2突變體，它的LBD來自於雌激素受體ER分子，當有tamoxifen的時候，Cre才能介導基因重組，這樣通過控制tamoxifen的注射時間，可以實現對基因重組時間特異性的調控；
對loxP元件的改造：loxP元件也有一些突變體，間隔區和迴文序列都可以進行突變，突變後的序列依然能被Cre重組酶識別和重組，但是突變的loxP序列必須和同樣突變的loxP序列匹配介導基因重組，而不能和未突變的loxP序列匹配，這樣將不同的loxP序列組合用於控制多個基因，在同一Cre重組酶的作用下，可以實現多序列的基因重組，產生非常多元的重組結果。例如彩虹腦（Brainbow）技術絢麗多彩的螢光標記效果正式基於對loxP序列的改造實現。
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