了解Cre/loxP 系統

2021-01-14 細胞生物學研會

實驗室同門曾說過這樣一句話調侃自己所學專業,「整天不是傳代就是『交配』」,傳代就是指細胞傳代,「交配」就是指構建小鼠,下午/晚上公鼠母鼠放一起交配,我們通常稱為「合籠」第二天查孕栓,之後就要進行基因型鑑定,PCR,配膠「交配」跑電泳。

在發育生物學、細胞生物學及生物化學與分子生物學的研究過程中,尤其是如果做傳統發育生物學實驗中,經常使用轉基因小鼠為研究對象,最常聽到「配鼠」。為了獲得實驗所需的轉基因小鼠,就必須了解Cre/loxP系統。


Cre/loxP系統是由NatSternberg 和 Daniel Hamilton 於1981年在噬菌體P1(Bacteriophage P1)的位點特異性重組研究中首次鑑定出來,其包含lox P 序列(locus of crossing(x) over P1);和識別 loxP序列的Cre重組酶(Causes Recombination)。

 LoxP序列含34 個鹼基,由兩個13bp的反向重複序列和一個8bp的不對稱間隔區組成。13bp的反向重複序列是Cre重組酶識別的位置,具有很高的保守性,8bp的間隔序列是DNA重組過程中Cre重組酶切割和連接的部位,其中間兩個鹼基具有保守性,同時也決定了loxP位點的方向性,從而決定 DNA 重組的方式。

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(N 表示鹼基可能發生變化)

 

Cre重組酶有343個胺基酸構成,分子量為 38KD,有4個亞基和兩個結構域構成——N末端結構域和C末端結構域,中間由12個胺基酸構成的短鏈連接。N末端結構域由20-120位胺基酸構成,包含5個α超螺旋結構,主要負責loxP序列的識別;C末端結構域由132-341位胺基酸構成,包含9個α超螺旋結構和2個β摺疊結構,是Cre重組酶的酶活性中心,負責與 DNA 的結合、切割和連接。

 


在 Cre酶的介導下, Cre/loxP定位重組系統共有4種重組方式:

1)當兩個同源loxP方向相同時,Cre重組酶介導刪除loxP位點之間的DNA序列,導致兩個位點之間的基因敲除;

2)當兩個同源loxP方向相反時,Cre重組酶介導lox P位點之間的DNA序列顛倒;

3)如果兩個同源loxP在兩個不同的DNA分子上,如兩個loxP序列分別位於同源染色體上,位於質粒上,而另一個loxP位於染色體上,在Cre重組酶的介導下質粒DNA便可以整合到染色體中loxP所在的位置上,導致DNA序列易位;

4)如果存在兩對異源loxP序列,分別位於兩個不同的DNA分子上,如一對位於質粒上,另一對位於染色體上,在Cre重組酶的介導下異源loxP之間的序列發生置換。



reloxp系統工作流程

利用Cre/loxP系統實現體內某特定基因在特定條件下的敲除,需要兩隻轉基因小鼠。第一隻小鼠一般採用胚胎幹細胞技術獲得,首先在體外構建一個在目的基因兩端分別含有一個loxP位點的基因序列,之後將體外構建好的這段基因序列轉入胚胎幹細胞內,使其通過同源重組替代細胞基因組內原來的基因序列。經過這樣處理的胚胎幹細胞被重新植入到假孕小鼠的子宮內,使其重新發育成為一個完整的胚胎,最終成為一隻轉基因小鼠。在這隻轉基因小鼠中,loxP位點被引入到相應基因的內含子內,理論上不會對相應基因的功能產生影響,因此一般情況下,該小鼠的表型是正常的。第二隻轉基因小鼠一般採用卵母細胞注射或者胚胎幹細胞技術獲得,在這隻小鼠中,Cre重組酶被置於某特定基因啟動子的調控之下,可以使其在某特定的條件下表達。最後,讓這兩隻小鼠進行交配,產生的同時含有上述兩種基因型的子代小鼠就會在某一特定類型的細胞中缺失某一特定的基因。

在何種組織細胞或器官中敲除某一特定的基因取決於所選擇的啟動子。只要選擇合適的啟動子調控Cre重組酶的表達,使其在生物體特定的部位、特定的條件下產生,就可以實現相應條件下某一特定基因的敲除。

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