Cre-loxP重組酶系統是一種位點特異的基因重組技術，可以迅速而有效地實現各種生理環境下的基因定點插入、刪除、替換和倒位等操作，具有高效性、特異性強、應用範圍廣等特點。近年來，科學家將合成生物學理念融入Cre-loxP重組酶系統中，開發出了一系列調控式的Cre-loxP重組酶系統，如化學方法誘導的Cre-loxP重組酶系統和紫光/藍光誘導的Cre-loxP重組酶系統。但這些誘導系統仍然具有一定程度的毒性，且紫藍光的組織穿透性差，極大地限制了Cre-loxP重組酶系統在動物體內的應用。
7月24日，華東師範大學生命科學學院、醫學合成生物學研究中心研究員葉海峰課題組在《自然—通訊》上發表最新研究成果，他們將合成生物學方法和光遺傳學技術相結合，設計開發了一套遠紅光調控的分割型Cre-loxP重組酶系統(簡稱FISC系統)，具有低毒、高度時空特異和強組織穿透性，成功實現在小鼠體內對靶基因的高效精確改造。
葉海峰向《中國科學報》介紹，他們利用課題組前期開發的遠紅光調控的哺乳動物細胞轉基因表達控制系統，將能響應遠紅光和合成c-di-GMP的光敏蛋白BphS，響應c-di-GMP的BldD蛋白以及Cre重組酶進行合理拼接組裝。研究人員將Cre重組酶分成CreN59（第1–59個胺基酸）和CreC60（第60–343個胺基酸）兩部分，其中CreN59與Coh2蛋白融合被組成型啟動子表達，CreC60與DocS蛋白融合被遠紅光誘導表達（圖1）。
圖1 FISC工作原理
首先，研究人員通過優化不同啟動子、不同質粒量、蛋白間連接肽以及不同Cre重組酶作用序列，得到了最優版本的FISC系統，最佳誘導基因表達倍數高達約120倍。另外，在哺乳細胞中測試了FISC系統動力學表徵，結果顯示在不同的報告蛋白和不同的細胞系中，FISC系統都展現出良好的調控效果。在HEK-293細胞中，FISC系統具有光照強度和時間依賴性以及高度的時空特異性（圖2）。
圖2 FISC的動力學表徵
隨後，研究人員通過流體動力學注射法將FISC系統遞送到BALB/c小鼠體內，探究FISC系統在體內的工作情況，並與目前已發表的兩套藍光調控Cre-loxP系統進行比較。結果，顯示FISC系統在體內展現出更高效的基因重組效率（54.4倍），這也充分體現了遠紅光的組織穿透性優勢，進一步證明了FISC系統在動物體內極具應用優勢（圖3）。
圖3 FISC系統在體內重組的工作情況
進一步地，研究人員採用電轉的方法，將FISC系統遞送到tdTomato轉基因報告小鼠肌肉中，小鼠經遠紅光照射後，在體內誘導合成的Cre重組酶會切割基因組上的loxP序列，切除STOP序列，表達tdTomato紅色螢光蛋白。結果發現，在mRNA和蛋白水平上FISC系統均展現出比藍光調控的Cre-loxP系統更高的DNA重組效率。
葉海峰介紹，腺相關病毒AAV因為其具有免疫原性低和非整合性等優勢，目前是臨床治療上應用較為廣泛的基因載體。為了實現體內高效遞送，研究人員將FISC系統構建在AAV載體上，利用AAV病毒將FISC系統遞送到tdTomato轉基因報告小鼠中。通過觀察小鼠活體成像和肝臟成像，與黑暗組小鼠相比，光照組小鼠紅色螢光蛋白表達量顯著升高（圖4），說明利用AAV載體成功實現了FISC系統在小鼠體內介導的DNA重組。
圖4 AAV病毒將FISC系統遞送到tdTomato轉基因報告小鼠
「FISC系統在體內外實現了精準可控的基因改造，並具有深度組織滲透能力和低毒性。」葉海峰告訴《中國科學報》，該研究將有望為細胞的命運圖譜的研究、功能基因的研究以及動物模型的構建等提供一種新策略。
據悉，該研究是葉海峰課題組在光遺傳學應用上的進一步的研究成果。2017年，該課題組在《科學—轉化醫學》期刊上發表了一篇研究文章，報導了一種遠紅光（730nm，LED）調控的轉基因表達控制系統，並實現了智慧型手機遠程控制光敏細胞釋放胰島素治療糖尿病的目標。2018年，該課題組在美國《國家科學院院刊》上發表研究論文，將遠紅光調控轉基因表達控制系統與CRISPR-dCas9技術相結合，開發了遠紅光調控的CRISPR-dCas9內源基因轉錄激活裝置（FACE），可實現表觀遺傳操控以及誘導幹細胞分化為功能性神經細胞。2020年，該課題組在《科學進展》上發表研究論文，將遠紅光調控轉基因表達控制系統與CRISPR-Cas9技術相結合，開發了一個遠紅光調控的分割型split-Cas9基因編輯系統（FAST），通過對小鼠腫瘤中的致癌基因進行編輯，成果實現了光控抑制腫瘤生長。一系列研究工作進一步拓展了光遺傳學工具箱，為精準可控的細胞治療和基因治療奠定了研究基礎，進一步推動了基於光遺傳學的精準治療和臨床轉化應用。
相關論文信息：https://doi.org/10.1038/s41467-020-17530-9
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