Cre-loxP重組酶系統是一種位點特異的基因重組技術，可以迅速而有效地實現各種生理環境下的基因定點插入、刪除、替換和倒位等操作，具有高效性，特異性強，應用範圍廣等特點【1】。近年來，科學家將合成生物學理念融入Cre-loxP重組酶系統中，開發出了一系列調控式的Cre-loxP重組酶系統，如化學方法誘導的Cre-loxP重組酶系統和紫光/藍光誘導的Cre-loxP重組酶系統【2,3】。但是這些誘導系統仍然具有一定程度的毒性，並且紫藍光的組織穿透性差，這些都極大地限制了Cre-loxP重組酶系統在動物體內的應用。
7月24日，華東師範大學生命科學學院、上海市調控生物學重點實驗室、華東師範大學醫學合成生物學研究中心葉海峰研究員團隊在Nature Communications上發表了題為「A non-invasive far-red light-induced split-Cre recombinase system for controllable genome engineering in mice」的最新研究成果，將合成生物學方法和光遺傳學技術相結合，設計開發了一套遠紅光調控的分割型Cre-loxP重組酶系統(簡稱FISC系統， far-red light-induced split Cre-loxP)，具有低毒、高度時空特異和強組織穿透性，成功實現在小鼠體內對靶基因的高效精確改造。
研究團隊利用該課題組前期開發的遠紅光調控的哺乳動物細胞轉基因表達控制系統【4】，將能響應遠紅光和合成c-di-GMP的光敏蛋白BphS，響應c-di-GMP的BldD蛋白以及Cre重組酶進行合理拼接組裝。研究人員將Cre重組酶分成CreN59（第1–59個胺基酸）和CreC60（第60–343個胺基酸）兩部分，其中CreN59與Coh2蛋白融合被組成型啟動子表達，CreC60與DocS蛋白融合被遠紅光誘導表達（圖1）。
圖1 FISC工作原理。在遠紅光照射下，細胞中的BphS利用GTP合成環二鳥苷酸c-di-GMP，c-di-GMP與轉錄激活結構BldD-P65-VP64 結合併進入細胞核，激活DocS-CreC60的表達；CreN59- Coh2在細胞中組成型表達。兩部分Cre在DocS與Coh2蛋白相互作用下重新合成完整Cre重組酶，識別報告基因中loxP位點切除STOP序列，起始下遊目的基因表達。
首先，研究團隊人員通過優化不同啟動子，不同質粒量，蛋白間連接肽以及不同Cre重組酶作用序列，得到了最優版本的FISC系統，最佳誘導基因表達倍數高達約120倍。另外，在哺乳細胞中測試了FISC系統動力學表徵，結果顯示在不同的報告蛋白和不同的細胞系中，FISC系統都展現出良好的調控效果。在HEK-293細胞中，FISC系統具有光照強度和時間依賴性以及高度的時空特異性。
隨後，研究團隊人員通過流體動力學注射法將FISC系統遞送到BALB/c小鼠體內，探究FISC系統在體內的工作情況，並與目前已發表的兩套藍光調控Cre-loxP系統進行比較，結果顯示FISC系統在體內展現出更高效的基因重組效率（54.4倍），這也充分體現了遠紅光的組織穿透性優勢，進一步證明了FISC系統在動物體內極具應用優勢。
同時，研究團隊人員採用電轉的方法將FISC系統遞送到tdTomato轉基因報告小鼠肌肉中（Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze），小鼠經遠紅光照射後，在體內誘導合成的Cre重組酶會切割基因組上的loxP序列，切除STOP序列，表達tdTomato紅色螢光蛋白。結果發現在mRNA和蛋白水平上FISC系統均展現出比藍光調控的Cre-loxP系統更高的DNA重組效率。
腺相關病毒AAV因為其具有免疫原性低和非整合性等優勢，目前是臨床治療上應用較為廣泛的基因載體。為了實現體內高效遞送，研究團隊人員將FISC系統構建在AAV載體上，利用AAV病毒將FISC系統遞送到tdTomato轉基因報告小鼠中。通過觀察小鼠活體成像和肝臟成像，與黑暗組小鼠相比，光照組小鼠紅色螢光蛋白表達量顯著升高。這說明利用AAV載體成功實現了FISC系統在小鼠體內介導的DNA重組。
總之，FISC系統在體內外實現了精準可控的基因改造，並具有深度組織滲透能力和低毒性。這項研究將有望為細胞的命運圖譜的研究、功能基因的研究以及動物模型的構建等提供一種新的策略和方法。
據悉，葉海峰研究員為該論文的通訊作者，2017級博士研究生吳嘉麗、王美豔副研究員和2018屆碩士研究生楊雪平為該研究論文的共同第一作者。
本研究是葉海峰課題組在光遺傳學應用上的進一步的研究成果。2017年，該課題組在Science Translational Medicine期刊上發表了一篇研究文章（【獨家專訪】華東師大葉海峰組首次通過智慧型手機實現遠程調控治療糖尿病），文章報導了一種遠紅光（730 nm，LED）調控的轉基因表達控制系統，並實現了智慧型手機遠程控制光敏細胞釋放胰島素治療糖尿病的目標。2018年，該課題組在PNAS上發表研究論文（亮點推薦丨葉海峰組實現遠紅光控制細胞命運），將遠紅光調控轉基因表達控制系統與CRISPR-dCas9技術相結合，開發了遠紅光調控的CRISPR-dCas9內源基因轉錄激活裝置（FACE），可實現表觀遺傳操控以及誘導幹細胞分化為功能性神經細胞【5】。2020年，該課題組在Science Advances上發表研究論文（亮點推薦 | 葉海峰團隊利用「光刀」實現基因時空特異性的精準編輯），將遠紅光調控轉基因表達控制系統與CRISPR-Cas9技術相結合，開發了一個遠紅光調控的分割型split-Cas9基因編輯系統（FAST），通過對小鼠腫瘤中的致癌基因進行編輯，成果實現了光控抑制腫瘤生長【6】。該一系列研究工作進一步拓展了光遺傳學工具箱，為精準可控的細胞治療和基因治療奠定了研究基礎，進一步推動了基於光遺傳學的精準治療和臨床轉化應用。
原文連結：
https://www.nature.com/articles/s41467-020-17530-9
來源：Bioart
參考文獻：
1. Lim L, Pakan JMP, et al. Optimization of interneuron function by direct coupling of cell migration and axonal targeting.Nat Neurosci, 2018.21(7):920-931.
2. Kellendonk C, et al. Regulation of Cre recombinase activity by the synthetic steroid RU 486.Nucleic Acids Res, 1996. 24(8): 1404-11.
3. Kennedy, M J, et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells.Nat Methods, 2010. 7(12): 973-5
4. Shao J, and S Xue, et al. Smartphone-controlled optogenetically engineered cells enable semiautomatic glucose homeostasis in diabetic mice.Sci Transl Med, 2017. 9(387).
5. J. Shao, M. Wang, G. Yu, S. Zhu, Y. Yu, B. C. Heng, J. Wu, H. Ye, Synthetic far-red light-mediated CRISPR-dCas9 device for inducing functional neuronal differentiation.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.115, E6722-e6730 (2018).
6. Y. Yu, X. Wu, N. Guan, J. Shao, H. Li, Y. Chen, Y. Ping, D. Li, H. Ye, Engineering a far-red light–activated split-Cas9 system for remote-controlled genome editing of internal organs and tumors.Sci. Adv.6, eabb1777 (2020).