亮點推薦 | 葉海峰團隊利用「光刀」實現基因時空特異性精準編輯
2020-07-11 BioArt責編 | 酶美
近年來，CRISPR-Cas9技術作為新興基因編輯技術，在生命科學領域掀起了一場全新的技術革命【1】。作為第三代基因編輯技術，相比於第一代基因編輯技術鋅指樣核酸酶（ZFNs）和第二代基因編輯技術轉錄激活樣效應子核酸酶（TALENs)，既保證了良好的打靶效率，又更加簡便、快捷、高效，且成本也大大降低，廣受科學界矚目。該技術幾乎可以在任何物種的任何位置發揮作用，為研究細胞複雜的生物學功能提供了極其便利的技術手段，為解決人類基因疾病帶來了希望和光明，成為生命科學史上具有裡程碑意義的生物技術。
但在享受該技術帶給我們便利的同時，也不得不正視其缺點。客觀地說，無論在基礎研究中還是在臨床治療上，該技術的應用仍然存在很多較難解決的問題，包括：（1）由於Cas9表達的不可控性導致的脫靶效應，這會帶來嚴重、不可預估的副作用【2】；（2）無法實現時空特異性的精準編輯。針對上述問題，亟需開發一種可時空特異性精準控制的CRISPR-Cas9系統，即給傳統的CRISPR-Cas9系統加上可時空特異性控制的光控「開關」，只有「開關」打開時，系統才能工作。這樣做的目的在於不會讓Cas9核酸酶持續高表達，只有當我們需要它的時候，它才會產生，從而極大地降低脫靶效應，同時利用光本身的優勢實現時空特異性的精準控制。
2020年7月10日，華東師範大學生命科學學院、上海市調控生物學重點實驗室、華東師範大學醫學合成生物學研究中心研究員葉海峰團隊在Science Advances雜誌上發表了題為Engineering a far-red light–activated split-Cas9 system for remote-controlled genome editing of internal organs and tumors的最新研究成果，巧妙地將合成生物學、光遺傳學、基因編輯多學科技術交叉融合，開發了一個遠紅光調控的分割型split-Cas9基因編輯系統（簡稱FAST系統），該系統以較低強度的遠紅光外部照射作為控制手段，藉助於遠紅光本身的組織通透性優勢，克服了目前化學小分子調控以及藍光調控CRISPR-Cas9系統的缺點，具有遠程無痕、低本底洩露、低脫靶效應、低毒性等體內應用優勢，能夠在時間和空間上特異性的精準控制體內深層組織和器官的基因編輯。
研究者利用合成生物學的設計原理，將紅細菌中響應遠紅光的蛋白BphS，鏈球菌中的轉錄因子BldD【3】以及釀膿鏈球菌中的Cas9核酸酶經理性設計、組裝和重編程構成了遠紅光調控的分割型split-Cas9基因編輯系統（far-red light–activated split-Cas9 system, FAST），其中Cas9核酸酶被分為N端（第1-713個胺基酸）和C端（第714-1368個胺基酸）兩部分，分別融合了來自熱纖維梭菌的一對能夠自發相互結合的蛋白Coh2和DocS【4】（圖1）。
圖1. FAST系統的工作原理圖。A，融合了Coh2蛋白的N端Cas9與融合了DocS蛋白的C端Cas9可以在Coh2和DocS蛋白的自發相互作用下形成完成的Cas9核酸酶。B，DocS和C端Cas9融合蛋白由人類巨細胞病毒啟動子（PhCMV）強啟動表達，N端Cas9和Coh2融合蛋白由遠紅光誘導表達。當兩種融合蛋白均表達完成時，N端Cas9和C端Cas9可以在Coh2和DocS的自發相互作用下結合到一起，形成完整的有功能Cas9核酸酶，進而在sgRNA的引導下發揮基因編輯功能。
首先，研究者們在細胞水平測試了FAST系統的基因編輯功能。實驗結果顯示，FAST系統在LED發射的低強度遠紅光照射下可以誘導細胞內單個或多個內源基因的編輯，包括非同源末端連接（NHEJ）和同源定向修復（HDR），且黑暗情況下幾乎無本底洩露。FAST系統在多種細胞中均顯示出可調控的基因編輯效果，並具有很好的光照強度和時間依賴性，以及高度的時空特異性（圖2），為研究FAST系統在動物體內的可調控基因編輯能力奠定了基礎。
圖2. FAST系統的表徵測試。FAST系統介導的時空特異性基因編輯。
隨後，研究者們將FAST系統通過流體動力學尾靜脈注射方式遞送至tdTomato轉基因報告小鼠（Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato) Hze，含loxP-STOP-loxP-tdTomato cassette]的肝臟中，只有當Cas9對loxP-STOP-loxP終止信號區的DNA進行切割編輯後，tdTomato紅色螢光蛋白才能表達出來。因而，通過觀察小鼠肝臟部位tdTomato的表達情況可以得知肝臟細胞中DNA被編輯的情況。肝臟器官成像和組織冰凍切片結果顯示，與黑暗組相比，光照組小鼠肝臟中的tdTomato基因有顯著的表達（圖3）。
圖3. FAST系統在tdTomato轉基因模型小鼠體內的基因編輯情況。A，FAST系統在tdTomato轉基因模型小鼠體內實驗的時間進程安排以及作用原理圖。B，肝臟成像圖。C，肝臟成像相對螢光強度統計值。D，肝臟組織冰凍切片螢光成像圖。
最後，研究者們在異種移植腫瘤（A549）模型小鼠中驗證了FAST系統的疾病治療應用潛力。將FAST系統遞送至小鼠體內的腫瘤中，通過LED遠紅光的照射使得FAST系統切割腫瘤致癌基因PLK1即可顯著抑制腫瘤的生長。上述體內研究結果均證明FAST系統中使用的LED來源的低強度的遠紅光照射具有良好的組織穿透力和體內應用效果。
總之，FAST系統不僅在體外培養的多種細胞中實現了內源基因的光控基因編輯，而且可以對動物體內的成體細胞實現光控基因編輯。研究人員還利用該系統對小鼠腫瘤中的致癌基因進行編輯，實現了光控抑制腫瘤生長的效果。
這項研究作為一個精準、時空可控的基因編輯技術平臺，提供了一種新型可控的基因編輯工具，擴展了當前CRISPR-Cas9基因編輯工具箱，有望應用於基因功能的研究，以及遺傳病、腫瘤等多種疾病的精準可控治療。
葉海峰研究員（左）為該研究論文的通訊作者，博士研究生於袁歡（右）為該研究論文的第一作者。
本研究成果是在葉海峰課題組近年來的光遺傳學研究基礎之上取得的進一步研究成果。2017年，該課題組在Science Translational Medicine期刊上發表了一篇研究文章（封面文章，專家點評 | 葉海峰團隊首創通過綠茶可控精準基因表達裝置），文章報導了一種遠紅光（730 nm）調控的轉基因表達控制系統，並實現了智慧型手機超遠程控制光敏細胞釋放胰島素治療糖尿病的目標，顛覆了傳統口服和注射降糖藥物控制血糖的方法【3】。2018年，該課題組在美國科學院院刊PNAS上發表研究論文，他們將遠紅光調控轉基因表達控制系統與CRISPR-dCas9技術相結合，開發了遠紅光調控的CRISPR-dCas9內源基因轉錄激活裝置（FACE），可實現表觀遺傳操控以及誘導幹細胞分化為功能性神經細胞（亮點推薦丨葉海峰組實現遠紅光控制細胞命運）【5】。該系列研究工作進一步拓展了光遺傳學工具箱，為哺乳動物細胞治療，細胞基因組的精密時空表觀遺傳調控、基因調控的基礎理論研究和轉化應用研究奠定了基礎，進一步促進了基於光遺傳學的精準治療和臨床轉化研究。
通訊作者簡介
葉海峰，華東師範大學研究員、博士生導師。2007–2013年於瑞士蘇黎世聯邦理工學院 (ETH Zurich) 從事博士和博士後研究工作。2013年被授予 ETH Zurich 最高榮譽獎章：「ETH Silver Medal」。現擔任國家重點研發計劃合成生物學重點專項1項、國家創新人才推進計劃「中青年科技領軍人才」入選者，國家「青千」和「優青」獲得者。主要從事合成生物學與生物醫學工程領域的研究。主要研究內容為光遺傳學與疾病治療、代謝疾病智能診療器件、腫瘤免疫治療智能診療器件、合成生物學與再生醫學。相關研究成果以第一或通訊作者身份發表在 Science、Sci Transl Med (2 篇封面)、Sci Adv、Nat Biomed Eng、Proc Natl Acad Sci USA (2 篇) 等期刊。申請發明專利 11 項。擔任中國生物工程學會合成生物學專業委員會委員、中國生物工程學會青年工作委員會委員、上海市生物工程學會第七屆理事會理事、上海市生物工程學會合成生物學專業委員會副主任委員。中國醫藥生物技術協會合成生物技術分會委員。
原文連結：https://advances.sciencemag.org/content/6/28/eabb1777.full
製版人：琪醬
參考文獻
1.L. Cong, F. A. Ran, D. Cox, S. Lin, R. Barretto, N. Habib, P. D. Hsu, X. Wu, W. Jiang, L. A. Marraffini, F. Zhang, Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013).
2. Y. Fu, J. A. Foden, C. Khayter, M. L. Maeder, D. Reyon, J. K. Joung, J. D. Sander, High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat. Biotechnol. 31, 822-826 (2013).
3. J. Shao, S. Xue, G. Yu, Y. Yu, X. Yang, Y. Bai, S. Zhu, L. Yang, J. Yin, Y. Wang, S. Liao, S. Guo, M. Xie, M. Fussenegger, H. Ye, Smartphone-controlled optogenetically engineered cells enable semiautomatic glucose homeostasis in diabetic mice. Sci. Transl. Med. 9, eaal2298 (2017).
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