華東師範大學科學家課題組在光控基因重組領域再獲進展

　　繼7月10日在Science Advances 上發表遠紅光調控的分割型split-Cas9基因編輯系統後，7月24日，華東師範大學生命科學學院，華東師範大學醫學合成生物學研究中心葉海峰研究員團隊再次在Nature Communications上發表題為「A non-invasive far-red light-induced split-Cre recombinase system for controllable genome engineering in mice」的最新研究成果，利用光遺傳學與合成生物學理念設計開發了一套遠紅光調控的分割型Cre-loxP重組酶系統(簡稱FISC系統)。該研究成果是繼遠紅光控制細胞命運（FACE系統），遠紅光控制基因編輯後（FAST系統）的又一大重要應用，極大地拓寬了光遺傳學的應用領域。

葉海峰研究員團隊在Nature Communications上發表成果

　　Cre-loxP重組酶系統是一種位點特異的基因重組技術，可以迅速而有效地實現各種生理環境下的基因定點插入、刪除、替換和倒位等操作。傳統的Cre-loxP重組酶系統存在早期胚胎致死和長期表達的毒性問題。近年來，科學家將合成生物學理念融入Cre-loxP重組酶系統中，開發出了一系列調控式的Cre-loxP重組酶系統，但是這些誘導系統仍然具有一定程度的毒性，且組織穿透性差，這些都極大地限制了Cre-loxP重組酶系統在動物體內的應用。

　　為了解決以上科學問題，該研究以低強度的遠紅光外部照射作為控制手段（730nm，LED光源），藉助於遠紅光本身的組織器官通透性高優勢，很好地解決了上述的組織穿透性差和毒性大的問題，實現了非侵入性的安全有效遠程無痕控制。在課題組多年的研究經驗和積累之上，研究團隊將響應遠紅光和合成c-di-GMP的光敏蛋白BphS，響應c-di-GMP的BldD蛋白以及Cre重組酶進行合理拼接組裝，開發了一套遠紅外光調控的分割型Cre-loxP重組酶系統。該系統主要是將Cre重組酶分成CreN59（第1–59個胺基酸）和CreC60（第60–343個胺基酸）兩部分，其中CreN59與Coh2蛋白融合被組成型啟動子表達，CreC60與DocS蛋白融合被遠紅光誘導表達。兩部分分割的Cre重組酶在DocS與Coh2蛋白自發相互作用下重新形成有功能的完整Cre重組酶，進而識別報告基因中loxP位點切除阻止基因表達的STOP序列，從而啟動目的基因表達(圖1)。

圖1.FISC系統工作原理

　　按照預期設計系統元件後，研究團隊人員在人胚胎腎細胞HEK-293中進行測試，發現結果並不理想，在黑暗條件下的背景過高。如何進一步降低本底的洩露至關重要，研究團隊人員通過優化不同啟動子，不同質粒量，蛋白間連接肽以及不同Cre重組酶作用序列，終於獲得了最優版本的FISC系統。然後，研究團隊人員在哺乳細胞中測試了FISC系統動力學表徵，結果顯示在不同的報告蛋白和不同的細胞系中，FISC系統均展現出良好的調控效果，並且具有光照強度和時間依賴性以及高度的時空特異性。

　　Cre-loxP重組酶系統在擬南芥、水稻、果蠅、斑馬魚、小鼠等多種高等真核生物體內均被廣泛應用。這裡，研究人員在小鼠體內測試了FISC系統的工作情況。利用流體動力學注射和電刺激兩種不同方法將FISC系統遞送至小鼠體內，同時與已發表的兩套藍光調控Cre-loxP系統進行比較，結果顯示FISC系統在體內展現出更高效的重組效率，這也充分體現了遠紅光的組織穿透性優勢，進一步證明了FISC系統在動物體內極具應用優勢(圖2)。

圖2.FISC系統在小鼠體內介導的DNA重組效果

　　隨後，研究團隊將FISC系統構建在腺相關病毒AAV載體上，利用AAV病毒將FISC系統遞送到tdTomato轉基因報告小鼠（Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze）。該轉基因報告小鼠經過遠紅光照射後，在體內誘導合成的Cre重組酶會切割基因組上的loxP序列，切除STOP序列，表達tdTomato紅色螢光蛋白。通過觀察小鼠活體成像和肝臟成像發現，與黑暗組小鼠相比，光照組後小鼠螢光蛋白表達量更高。這充分說明利用AAV載體成功實現了FISC系統在小鼠體內的高效DNA重組。

圖3.AAV病毒將FISC系統遞送到tdTomato轉基因報告小鼠介導DNA重組

　　總之，研究團隊研發的FISC系統成功在體內外實現了精準可控的基因改造，具有非侵入性，深度的組織穿透能力，低毒性以及空間特異性。FISC系統擴展了DNA重組的光遺傳學工具箱，有望為細胞的命運圖譜的研究、功能基因的研究以及動物模型的構建等研究提供一種新的策略和方法。

　　該論文的通訊作者為華東師範大學生命科學學院葉海峰研究員。2017級博士研究生吳嘉麗、王美豔副研究員和已畢業2018屆碩士研究生楊雪平為該研究論文的共同第一作者。該研究受到了國家重點研發計劃「合成生物學」重點專項、上海市科委合成生物學重大項目以及國家自然科學基金的大力支持。

　　據悉，本研究是葉海峰課題組在光遺傳學應用上的進一步的研究成果。2017年，課題組在Science Translational Medicine期刊上發表了一篇研究文章報導了一種遠紅光（730 nm，LED）調控的轉基因表達控制系統，並實現了智慧型手機遠程控制細胞釋放胰島素治療糖尿病的目標。2018年，該課題組在美國科學院院刊PNAS上報導了遠紅光調控的CRISPR-dCas9內源基因轉錄激活裝置（FACE），可實現表觀遺傳操控以及誘導幹細胞分化為功能性神經細胞。2020年，該課題組在Science Advances 上報導了一個遠紅光調控的分割型split-Cas9基因編輯系統（FAST），通過對小鼠腫瘤中的致癌基因進行編輯，成果實現了光控抑制腫瘤生長。該一系列系統性研究工作進一步拓展了光遺傳學工具箱，為精準可控的細胞治療和基因治療奠定了研究基礎，進一步推動了基於光遺傳學的精準治療和臨床轉化應用。