2016年9月15日，《Genome Biology》報導了一種基於SGN的基因編輯新技術，以結構引導的內切酶（SGN，Structure-guided nuclease）實現體內外DNA任意序列的靶向和切割。論文一作為Shu Xu，論文通信作者為南京大學醫學院附屬金陵醫院的周國華（Guohua Zhou）研究員、南京大學模式動物研究所的趙慶順（Qingshun Zhao）教授和朱敏生（Minsheng Zhu）教授。做為基因編輯領域的從業者，讀後很有感觸，應BioArt主編之邀請，以半學術的方式、以隨筆的形式寫出，與各位分享，不嚴謹之處請大家各自消毒。
感觸之一：構思巧妙，略有瑕疵，瑕不掩瑜。論文中，作者巧妙地融合FEN1（Flap endonuclease-1，是一種可以特異性識別flap結構的核酸內切酶，參與DNA的複製，修復和重組過程；除此之外它還具有雙鏈DNA特異的5『-3』的核酸外切酶活性）和已經被成功用於ZFN和TALEN的DNA剪切結構域Fok I，結合標準化的linker（GS repeats），設計了一個chimeric protein，實現了可編程的基因編輯系統，具有以下特點：短鏈ssDNA導向的基因組特定位置；編輯結果是產生大片段的deletion（可以大於2.6kb）；可以在斑馬魚胚胎中成功編輯內源基因。這個構思，看得出包含ZNF以及TALEN的影子，其實這三者設計思路是一致的，其創新點在於靶向元件的選擇十分巧妙，切割元件直接me too。令人驚喜的是，這種原創性工作出自我們中國科學家團隊，略有遺憾的是，論文中體內靶點做的偏少，也沒有以CRISPR或者TALEN為對照，導致尚不能夠評估其相對低的編輯效率是來自位點特異性障礙還是來自技術本身（znf703基因編輯效率1/96≈1%；cyp26b1基因編輯效率是3/29≈10%、這個位點還真不低）。另外一點，如果SGN系統編輯結果是產生大片段的deletion，那麼後期的同源重組做起來要相對困難（冒昧的揣測一下：FEN-1外切酶活性是否可以dead？貌似大片段的deletion應該是5'-3'的核酸外切酶活性引起的）。
感觸之二：表述質樸謙遜，留下很大的優化空間。通篇論文讀下來，科學之外，還感覺到一種相對質樸的文風，措辭之間充盈著謙遜。這麼講，可能超出了學術範疇，所以稱之為隨筆，既然自己給自己開了這麼一個後門，所以，乾脆就談出來，好在筆者與南京大學與作者沒有關聯，也就沒有了套磁之嫌疑。例如，在基本術語上作者沒有跟風：「SGN」而不是「ssDNA guided Nuclease」，「DNA editing」而不是「genome editing」，這些細節都能夠體現出一種「獨立性」。基因編輯技術的效率是極其重要的，目前看在這篇論文中，作者沒有更多地報導相關的條件優化工作，例如效率瓶頸是存在於guide DNA與靶向區域的結合效率？還是存在於SGN的識別效率？整個生物學場景之中，目標區域的DNA melting究竟有多重要？是轉錄相關事件還是複製相關事件？（冒昧的揣測一下：是不是質粒編輯實驗中採用可誘導啟動子即可幫助判斷？）當然，不應該要求一篇論文解決和回答這麼多的科學或技術問題，但是可以預計，這個新工具可能還有較大優化空間，期待著他們更多的進一步報導。
感觸之三：就是要挑戰CRISPR，儘管它似乎難以逾越！眾所周知，今年5月2日《Nature Biotechnology》在線發表河北科技大學韓春雨博士「一鳴驚人」的論文，報告了一種NgAgo-gDNA基因編輯新工具，儘管因不可重複而使韓春雨「一波三折」地陷入學術誠信危機，但是，此文也算是高調地揭開了挑戰CRISPR暗中競賽的蓋子。儘管CRISPR如日中天，甚至有「long live CRISPR」之類的戲言，但是，CRISPR並不完美，這種「不完美」不僅僅來自Off-target、PAM的限制性、難以實現單鹼基精確編輯之類的技術瑕疵，更是來自人類對新技術的「天然貪婪」，來自根深蒂固的奧林匹克精神「更快、更高、更遠」，來自我們骨子裡的徵服欲。正如哈佛大學醫學院遺傳學教授George Church所言：新技術都是脆弱的，隨時可能被取代；加州大學聖地牙哥分校的Prashant Mali 說的更直白「我們需要的不止這些」。所以，從技術使用者的角度看，CRISPR是大自然和幾位先鋒科學家送來的珍貴禮物，在欣然擁抱它的同時、當然也期待著更好的技術出現；從技術開發者的角度看，大紅大紫般火熱的CRISPR又是新的競賽標杆，它令人嫉妒地、高傲地立在那裡，挑逗和激發著人們超越它的衝動。
感觸之四：源自天然、超越天然，從基因編輯技術演化史看「工程化」在技術工具開發中的重要性。有人把基因編輯技術做了「斷代工程」，給技術劃代，很形象、也利於普及，但是有時候也比較困難。
一般地，理論上可以在哺乳動物細胞中近乎任意位點切割並引發編輯的ZFN、TALEN以及CRISPR，它們在時間節點上依次出現、而且效率和便利性也越來越好，所以被稱為第一代、第二代、第三代基因編輯技術（1G、2G、3G）。筆者願意把他們稱之為大眾基因編輯工具，因為對應著的還有一些小眾工具，鑑於其自身的技術局限和缺陷，並沒有被大家普遍接受。今天，先聊一聊大眾工具，隨後加一些小花邊，再聊聊那些正在被淘汰和被遺忘的小眾工具，補充這些小眾工具的演化史，可以更加清晰地看出技術發展脈絡，或許從中獲得另外的靈感和啟發。
從大眾工具看，「工程化」貫穿始終。現代中文語境中，一直有一種混淆科學與技術的「語義學」困境。科學與技術相關但不相同，有人形象地這樣區分科學與技術：know what，know why是科學，know how是技術。基因編輯總體上是一種技術，其相關工具的開發，起步於科學發現，但是不止步於科學發現。例如，從現有公開文獻看，CRISPR最重要的科學發現節點是2011年卡彭蒂艾（Emmanuelle Charpentier）對tracrRNA的生物學功能的闡明。但是，有時候，造物主很懶，他開闢了這個世界之隨後可能置之不理了。所以，大自然留給我們的禮物，有時候配不上我們徵服的野心，因此，就人類目標而言，我們從來都不吝嗇和遲疑於改進和再造。果然，隨後的2012年，卡彭蒂艾就會同詹妮弗·刀娜（Jennifer A. Doudna）聯合發表了劃時代論文，把tracrRNA和guide RNA合二為一，做成了工程化的「chimeric single guide」，sgRNA由此誕生。而在CRISPR-Cas工程化、模塊化方面貢獻最大的，應該首推華人科學家張鋒教授。除CRISPRi、 CRISPRa之外，早在2013年的綜述中，張鋒教授就展望了包括把Cas設計為光控模式在內的各類工程化方案。而就是在本月，又推出了兩項以遙控sgRNA的方式對CRISPR實施即時控制的技術方案。哈佛和神戶大學的團隊先後發表了利用「工程化」措施將AID與dCas9做成chimeric protein實現了不依賴於同源重組的單鹼基編輯。就在本月初，MIT的團隊創建了光敏感的sgRNA技術；幾乎與此同時，深圳的科學家團隊報告了「化學控制」的sgRNA的控制技術。
讓我們把視野再回望到ZFN和TALEN，更是工程化的傑出案例，直至今天討論的SGN，其「動作模塊」甚至「毫不動搖」地使用FokⅠ，所變換進化的是「GPS定位模塊」。這堪稱技術演化之中還留下了歷史痕跡，好似「保守序列」一樣，讓人驚嘆「自然進化」與「人工進化」異曲同工之奇妙。
所以，基因編輯工具開發工程化的基本方程式是：GPS定位模塊+執行模塊。話分兩頭說。
先聊「執行模塊」。FokⅠ屢戰屢勝，但是，一定還有其它選擇，畢竟，造物主應該是慷慨的，地球生命演化了四十億年，留下的自然遺產極為豐富。
再聊聊GPS定位模塊。這個模塊工作效率及操作便利性如何，是基因編輯工具「好不好使」的關鍵。ZFN和TALEN的主要特點是：以蛋白質特定結構域來完成靶向定位，其主要缺陷是：定位模塊體外準備麻煩，工作量大成本高；相比之下，CRISPR-Cas卻方便的多，所以在總體競爭中勝出。但是CRISPR-Cas還是或多或少存在Off-target的弊端，為了解決這個問題、進一步強化定位精準性，已有報導以dcas9為定位器，融合上FokⅠ，實現正義鏈和反義鏈雙向定位、並形成FokⅠ二聚體造成DNA雙鏈斷裂（DSB）、引發編輯。本次討論的南京大學的這篇文章，再一次創新了GPS定位模塊，首次採用FEN-1（flap endonuclease-1）來執行定位功能，將定位指令轉化為方便人工編程的guide-ssDNA，做的很巧妙。
聊到這裡，下一個創新近似於呼之欲出：儘管NgAgo似乎失敗了，但是它工程化改造的前景呢？pAgo做為基因組「GPS定位模塊」的可能性，怎能不令工具開發者怦然心動，就連我那個簡陋的實驗室，都已經於幾個月前就開始努力了，萬一大牛們漏掉了某些創意呢？
總之，GPS定位模塊+執行模塊=基因編輯工具，兩個模塊的重點是定位模塊。設計靈感源自天然存在的自然遺產、但不止步於天然存在。自然界留給我們很多的提示和啟發，例如：位點特異重組酶（site specific recombinase）如何？整合酶（integrases）如何？轉座酶（transpotase）如何？其它未知的recombinase如何？這個領域的幹法和溼法挖掘競賽應該一直在進行。張鋒曾說到：「通過對多種酶進行探索，我們可以得到一個更強的基因組編輯工具箱。我們必須繼續探索未知。」
最後的花邊：從G0談起，回顧一下「淪落」為小眾的基因編輯工具。上世紀七十年代末，利用限制性內切酶實現了質粒體外重組，標誌著第一代基因工程的誕生。隨後，基於同源重組的體內染色體水平的基因工程成為現實，但是由於重組率極低，必須使用抗生素抗性或營養缺陷等標記加以篩選，做不到無痕編輯。之後，儘管發展了反向篩選標記、cre位點預埋及抗性回收等技術措施，但是，還是繁瑣和低效。業界對無標記的無痕基因編輯技術是十分期待的，無標記無痕的關鍵在於編輯效率，只要效率達到百分之一以上的數量級別，就有希望。這裡讓我們一起回顧一下兩個小眾工具，作為「綠葉」來襯託一下廣為人知的大眾工具。
其一，G0代的重組工程（Recombineering）。上世紀90年代末，基於λ噬菌體的Red重組酶的重組工程（Recombineering）出現了，這個領域中，中國科學家於代冠（Daiguan Yu）跟隨NIH的Donald L . Curt，做出了不少貢獻，於代冠博士後來回到了中科院廣州生物醫藥與健康研究院。基於Red系統，哈佛大學George Church於2008年在《Nature Biotechnology》上發表了改進版的MAGE，可以自動化地在數天內引發十億計的突變；至2013年，Church又把基於ss-oligo的的重組工程從大腸桿菌擴展到釀酒酵母，這個過程還與rad51/rad54相關，被Church發展成YOGE技術，之所以特別強調Church，是因為這位偉大的科學家也是早期CRISPR的推進者之一，他採用Cas9編輯高等細胞基因組的論文，與張鋒「同框」於2013年1月的Science。但是，重組工程最終沒有能夠再擴展到其它物種，特別是沒有實現哺乳動物細胞的基因編輯。大腸桿菌的Red/ET系統，也是重組工程的重要實現工具，也是目前仍在普遍使用的分子生物學基本操作工具，這個系統源自中國科學家張友明在歐洲留學工作期間做出的開創性工作，張友明博士後來回到山東大學工作。總體上，基於寡核苷酸入侵的重組工程可擴展性不夠好（局限於原核的細菌、真核最多跨到釀酒酵母），效率相對低下（在千分之一到百分之一之間），難以大幅度優化。
其二，G2.5代的Targetron。這個來自原核微生物防禦機制的Targetron技術，筆者更願意把它稱之為2.5代技術，不是因為它的效率，而是因為它的GPS定位模塊的工作方式，其方式是結合了「個別DNA位點的蛋白質識別」和「其它位點的RNA識別」，而且識別序列是可編輯的、可以「reprogrammable」的。這個編輯工具的大本營首推德克薩斯大學奧斯汀分校，他們有對外開放的設計軟體及一些技術服務，但是，它編輯複雜、使用困難、物種可擴展性不高，梭狀芽孢桿菌是可以用的，中科院微生物所李寅組和上海的楊晟組都有相關工作。總之，仍然是一個小眾工具。
SGN將會如何？是小眾工具還是能夠發展成大眾工具呢？pAgo能不能進一步W為NgAgo「正名」？能不能正名之後再發展成大眾工具呢？前提是solid、可重複，並且用戶友好。讓我們拭目以待吧！
源於天然而超越天然，正道也！再次祝賀南京大學科學家在基因編輯領域的這項重大突破！
（原題為《源於天然，超越天然——南京大學周國華教授DNA編輯論文讀後感》）
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