韓春雨發表基因編輯新論文,發明基於CRISPR的RNA追蹤成像系統

2020-11-23 儀器信息網


近日，韓春雨在預印本網站BioRxiv發表了一篇關於基因編輯的新論文：Background free tracking of single RNA in living cells using catalytically inactive CasE.該研究開發了一種新型的活細胞RNA追蹤成像工具——VN-dCasE-VC，效果和可用性更強。該論文署名單位為河北科技大學基因編輯研究中心，通訊作者為韓春雨，第一作者為高峰。

前情回顧

2016年5月2日，韓春雨（河北科技大學）作為通訊作者在國際頂級學術期刊 Nature Biotechnology 雜誌發表了題為：DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute（使用NgAgo進行DNA引導的基因組編輯）的研究論文。

該研究稱NgAgo對真核生物（包括人）具有基因編輯能力。該研究成功很快在世界範圍內爆火，韓春雨老師此前籍籍無名，幾乎一夜之間成為學術界網紅，被讚譽為「在三流學校取得世界一流原創成果，打破國際基因編輯技術壟斷」。

該論文通訊作者為韓春雨，第一作者為高峰，浙江大學教授沈嘯為共同通訊作者，但在後續修改版本中，沈嘯從作者名單中去除了。

2016年8月，河北科技大學成立基因編輯研究中心，計劃投入資金逾2億元。但NgAgo的研究成果引發廣泛質疑，2017年8月3日，韓春雨撤回該論文。2018年8月31日，河北科技大學取消了韓春雨所獲得的榮譽稱號，終止了韓春雨團隊承擔的科研項目並收回了科研經費，收回了韓春雨團隊所獲校科研績效獎勵。

2019年4月4日，預印本網站BioRxiv刊登了一篇來自美國普渡大學研究人員的研究論文，表明NgAgo通過核酸內切酶活性介導增強大腸桿菌的同源重組。BioWorld第一時間解讀並報導了該論文，該研究表明NgAgo可以編輯原核生物，但不能編輯真核生物基因組。

韓春雨最新論文的解讀

CasE是Ⅰ-E型 CRISPR複合物的核心成分，它通過結合特定的莖環區域單獨處理pre-crRNA，稱之為 CasE Binding S，簡稱為CBS。CasE保守His20參與催化活性，ΔHis26-TtCse3突變的CasE（dCasE）則失去了催化活性，但仍然與其靶標緊密結合。

在該研究中，通過將 split 螢光與dCasE的N端和C-末端（ΔHis20）融合，構建了活體RNA跟蹤工具VN-dCasE-VC。該系統僅在存在靶RNA時才發出螢光，從而增強信噪比。

在活細胞中進行可視化的RNA追蹤，不需要特定的亞細胞分布。CasE-GFP和dCasE-GFP在HEK293T細胞中的高水平表達和均勻分布表明CasE和dCasE適合於活細胞中的RNA操作。

為了測試CasE在哺乳動物細胞中表達時是否具有強活性，作者構建了「關閉」報告基因質粒CBS-GFP-N1。它由5'-UTR中的GFP mRNA和CasE結合位點（CBS）組成。當CasE被引入系統時，GFP表達水平急劇下降。

為了進一步測試CasE活性，作者還構建了「開啟」報告基因質粒RED-16×CBS-Lin28-C1，其中CBS插入RED單體基因的3'-UTR區和Lin28的上遊。Lin28是RNA核保留信號，在其3'-UTR中具有lin28信號的RED單體mRNA幾乎不能翻譯成蛋白質。

CBS-CasE依賴限制性切斷lin28信號並從核釋放靶mRNA用於翻譯（圖1E和圖1F）。這些表明CasE可以結合併切割哺乳動物細胞中的CBS。

為了將dCasE-CBS相互作用設計到RNA追蹤系統中，作者通過將split-FP5-7與dCasE蛋白結合。發現一個版本，即VN-dCasE-VC很難發出螢光，這可能是由於不正確的摺疊或不穩定的狀態，但是當與靶RNA（CBS）結合時，可以在螢光顯微鏡下清楚地捕獲螢光信號，即使VN-dCasE-VC表達質粒的轉染劑量非常低。

接下來作者使用VN-dCasE-VC系統追蹤哺乳動物細胞中過表達的β-肌動蛋白（β-Actin）的mRNA，VN-dCasE-VC系統在細胞質中顯示出強螢光。此外還觀察到，向靶mRNA添加更多CBS可改善信號，螢光追蹤更清晰，因此，可以通過增加CBS的數量來檢測低豐度的mRNA。

總的來說，韓春雨團隊發明了一種新的RNA追蹤工具，將其命名為VN-dCasE-VC。該系統能夠追蹤活細胞中沒有背景的特定RNA，通過螢光將其可視化。

目前已有兩種活細胞RNA追蹤成像工具，一種是MS2，一種是Cas13a，韓春雨團隊開發的dCasE系統，成像效果由於MS2，而且，dCasE蛋白的分子量為22kDa，遠小於Cas13a的130kDa，dCasE的小分子量更容易遞送至細胞內，因此更適合用於活細胞的RNA追蹤。

需要特別說明的是，該研究目前發表於預印本網站，尚未經過同行評議。

通訊作者：韓春雨

第一作者：高峰

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