基因敲除法

基因敲除法

2008-01-21 11:43 作者：袁越 2007年第39期

因為「基因敲除法」具有如此強大的功能，諾貝爾委員會終於把2007年的醫學或生理學獎授予了卡佩奇、史密斯和埃文斯三人。這是21世紀該獎第三次授予一項工具性的研究。2003年是核磁共振，2006年是RNA幹擾。和「基因敲除」類似，RNA幹擾也能作為研究基因功能的絕佳工具。

因為「基因敲除法」具有如此強大的功能，諾貝爾委員會終於把2007年的醫學或生理學獎授予了卡佩奇、史密斯和埃文斯三人。這是21世紀該獎第三次授予一項工具性的研究。2003年是核磁共振，2006年是RNA幹擾。和「基因敲除」類似，RNA幹擾也能作為研究基因功能的絕佳工具。

50多年前，美國科學家約舒亞·萊德伯格（Joshua Lederberg）發現了基因的「同源重組」（Homologous Recombination）現象，因為這個發現獲得了1958年的諾貝爾醫學或生理學獎。這一現象說起來很簡單，大多數高等生物的細胞內含有兩套染色體，一套來自父親，一套來自母親。這兩套遺傳系統絕大部分都是一樣的，只在少數幾個地方有所不同。萊德伯格發現，來自父親的某段染色體會和來自母親的對應片斷髮生互換，這就好比兩個雙胞胎兄弟互相交換了一隻手一樣。

「同源重組」是生物界非常普遍的現象，從酵母到哺乳動物都會這麼做。廣義上講，「同源重組」是生物體增加變異程度的好方法，在進化上非常有用。從狹義上看，「同源重組」是細胞修復壞基因的辦法。比如，來自父親的A基因壞了，該細胞只要從來自母親的染色體上把相應的a基因複製下來，通過「同源重組」的辦法和壞了的那個A基因交換一下，就可以完成修復。因為A和a非常相似，所以交換過後對該細胞不會有太大的影響。

上世紀80年代初，美國猶他大學的馬裡奧·卡佩奇（Mario Capecchi）博士突發奇想，覺得「同源重組」可以作為工具，對染色體上的基因加以改造。具體做法是:先用靶細胞的某段DNA作為模板，在實驗室裡製作一段「同源」的DNA，然後把它導入細胞，誘導細胞的染色體和這段DNA發生「同源重組」。這樣一來，外來的DNA就可以準確地整合進細胞的染色體內，代替原來那段基因。

假設科學家在合成「同源」DNA時做點手腳，改變某個關鍵的順序，被修改後DNA仍然可以和細胞發生「同源重組」，但整合進細胞中的外源DNA卻是壞的，無法正常工作。這樣一來，這個基因就被人為地「敲除」（Knockout）了。經過大量試驗，卡佩奇證明這個方法是可行，人工引入的DNA片斷確實可以和細胞原有的染色體發生「同源重組」。

幾乎與此同時，美國北卡羅萊納大學的奧利弗·史密斯（Oliver Smithies）博士也在進行類似實驗。史密斯的目標是利用基因療法治療遺傳病，某些遺傳性血液病的病因是血紅細胞基因變異，史密斯設想利用「同源重組」把正確基因導入到骨髓造血細胞中，修改其錯誤。如果成功，病人就能依靠被修復的造血細胞生產健康的血紅細胞，病就治好了。

史密斯在實驗中發現，哺乳動物細胞中的任何一段基因都有可能發生「同源重組」，即使這段基因處於休眠狀態也是如此。這個發現意味著，哺乳動物的任何一段基因都有可能被人為地加以修改。

西醫最遭人詬病的一條就是缺乏整體觀。可是，事實上，現代生物學並不缺乏整體觀，只是根據目前的現狀，要想進行可控制的整體研究，還有很多困難需要克服。

比如，雖然卡佩奇和史密斯兩人找到了「定點改變任意基因」（英文叫Gene Targeting，基因靶向或基因打靶）的方法，但是他倆只能做到改變單個細胞內的基因。要想研究某個基因對於整個生命體的作用，就必須把該個體所有細胞中存在的該基因全部「敲除」，這可就難了。當年卡佩奇曾經向美國國立衛生研究院（NIH）申請研究基金，把這個方法用於哺乳動物，結果被NIH嚴詞拒絕。

但是卡佩奇沒有放棄，他偷偷挪用了自己從別的課題申請到的錢，用來資助這項研究，幾年後他終於證明這個思路是可行的。與此同時，史密斯也獨立地證明了這一點。只不過兩人都承認，他們採用的方法效率太低，不大可能有什麼實際的用途。

原來，要想把一隻小鼠體內某個基因的所有拷貝全部「敲除」，只能從受精卵開始。可是，兩人試驗了多次都沒能提高「同源重組」的效率，做一次這樣的試驗可能需要成千上萬個受精卵，所以當時科學界都認為這個方法在哺乳動物身上是行不通的。

天無絕人之路。正像前文所說的那樣，一旦生物學家需要找到某樣工具，都會習慣性地把目光轉向生命本身，這一次他們又找對了。

同樣在上世紀80年代初期，英國卡迪夫大學（Cardiff University）的馬丁·埃文斯（Martin Evans）博士偶然發現，小鼠受精卵發育到3.5天時候，會形成一個名叫「囊胚」（Blastocyst，也有人翻譯成「胚泡」）的小細胞團，其外層是一圈由扁平細胞組成的「滋養層」，保護著囊胚內的一小團特殊的細胞——「內細胞團」（Inner Cell Mass）。這幾十個細胞都是未分化的幹細胞，每個細胞都能發育成幾乎所有的組織和器官，所以科學家們把這些細胞叫做「胚胎幹細胞」（Embryonic Stem Cells）。

埃文斯並不是第一個發現這群細胞的人，但他卻是世界上第一個在實驗室條件下成功地繁殖胚胎幹細胞的人。具體說，他發現，只要模仿「囊胚」中的微環境，在培養皿底部鋪上一層不會分裂的細胞作為「滋養層」，就能讓培養皿中的幹細胞無限繁殖下去，同時又完整地保留幹細胞的「全能」特性。於是，埃文斯為「基因靶向」技術提供了足夠多的靶細胞。從此，卡佩奇和史密斯博士再也不必擔心「同源重組」的效率問題，他倆所要做的只是在人工合成DNA的時候偷偷塞進一個小小的「標記基因」（比如某個抗藥性基因），然後把DNA導入培養的幹細胞內，進行「同源重組」。這一過程的效率再低也沒關係，如果每100萬個細胞才能發生一次，那就用100萬個幹細胞好了，反正細胞有得是。之後，只要把抗生素加進培養皿中，殺死那些沒有發生「同源重組」的幹細胞，剩下的都是按照科學家的設計而被改變了的幹細胞。
只需得到一個「同源重組」幹細胞就足夠了，剩下來的工作就是把這個細胞進行繁殖，然後重新植入小鼠的囊胚中，再把囊胚植入一隻小鼠的子宮裡，就能生出一批帶有一部分這種特殊細胞的成年小鼠。如果被改變的那個幹細胞正巧變成了生殖細胞，就說明這隻小鼠的所有精子（或卵子）都被改變了。接下來只要再進行幾次選擇性的交配，就能生出一批從頭到腳所有細胞都被改變了的小鼠。

1989年，卡佩奇和史密斯發表論文，報告了世界上第一隻依靠「基因敲除」法得到的小鼠。全世界所有的生物學家們立刻意識到這個方法將給哺乳動物遺傳學研究帶來一個質的飛躍。

比如，你想研究一下A基因是如何致癌的嗎？以前人們只知道這個基因能使B分子水平升高，但小鼠為什麼因此而得癌症，誰也說不清。現在好了，只要把A基因「敲除」掉，然後觀察沒有該基因的小鼠體內發生了哪些變化，哪些分子的水平升高了，哪些細胞受到了影響……就行了。

這個方法讓科學家們第一次能夠在整體的水平上研究基因的功能。

自那時開始，全世界的實驗室一共培養了超過1.1萬種「基因敲除小鼠」，也就是說，有超過1.1萬種基因被定點地去掉了。這個數字大約相當於哺乳動物整個基因數量的一半。從此以後，如果科學家想研究一下小鼠的某個基因的功能，只要調出這個品系的小鼠，和正常小鼠比較一下就可以了。

目前科學家們正在致力於敲除剩下的一半基因，然後做成一個小鼠基因庫，把哺乳動物所有的基因都包括進來。到那時，任何一個基因都可以很方便地進行研究了。

小鼠和人的親緣很近，很多疾病的病理都是相似的，因此這些「基因敲除小鼠」可以作為人類疾病的「模型動物」，通過研究它們的發病機理，找出治療方法。

有人也許會問:萬一「敲除」掉的是一個對生命十分重要的基因怎麼辦？小鼠不就活不成了嗎？確實，有一部分基因對生命十分關鍵，是不能缺失的。為此科學家們發明了一種辦法，可以讓這些基因在小鼠成年之後再失去活性。事實上，目前「基因敲除小鼠」可以有很多種不同類型。比如，科學家可以讓基因只在特定的組織內失去活性，或者讓一個以上的基因同時失去活性（有些疾病需要兩種基因同時失效），甚至可以反其道而行之，人為添加某個基因到小鼠身體裡去，從而研究這種基因的功能（這種方法叫做「敲進」〔Knock-in〕）。

總之，任何一種與基因有關的疾病理論上都可以用「基因敲除小鼠」作為模型加以研究，「基因定點敲除」的方法只要稍加改造，就可以用來治療人類的很多遺傳性疾病。

目前，全世界的科學家已經建立了超過500個人類疾病的小鼠模型，從心血管疾病到癌症，應有盡有。有了這些模型，醫生們就可以方便地研究這些疾病的病因和治療方法。「（基因敲除法）徹底改變了生物學研究的面貌。」劍橋大學桑格研究所的所長艾倫·布拉德利（Allan Bradley）在評價「基因敲除法」時說。

值得一提的是，卡佩奇基和史密斯分別出生於義大利和英國，現在都已經加入了美國籍。美國作為全世界生物學研究的中心地位，再一次得到了諾貝爾獎委員會的肯定。另外，21世紀所有的8次諾貝爾醫學或生理學獎全部都由多名獲獎者分享，顯示這一領域的合作達到了前所未有的高度。要知道，該獎在上世紀20年代時候只有2次是多人獲獎，到了50年代，多人獲獎的情況增加到了4次，從1960開始直到現在，一共48屆諾貝爾獎，只有6次是單人獨享獎金。

需要指出的是，「基因敲除法」並不是完美無缺的，很多地方有待改進。比如小鼠和人並不完全一樣，有時不能照搬從小鼠身上得到的經驗。但是，這項研究目前最大的困難在於人們對胚胎幹細胞的懷疑態度，這種態度大多出自宗教人士對幹細胞倫理的質疑。■

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