很多年以來，鹼裂解法提取質粒DNA一直是標準的方法。但現在因為有大量的質粒提取試劑盒，更方便快捷，研究人員也更喜歡用試劑盒來提取，但是試劑盒的最大問題在於試劑盒本身是一個黑盒子，只知道怎麼用而不知道具體每個組分的作用。這樣的研究人員缺乏對實驗原理學習的興趣，在出現問題之後也缺乏找到正確解決問題的方向。本文詳細描述了鹼裂解法的操作和原理，方便在以後的實驗中就算用試劑盒也能理解每個步驟的作用，並且對實驗中出現的問題進行思考和解決。
鹼裂解法抽提質粒流程
SDS鹼裂解法製備質粒DNA
該實驗方案的目的是從少量（1~2mL）細菌培養物中分離質粒DNA。DNA產量為100ng~5μg,這取決於質粒的拷貝數。少量的DNA作為體外酶促反應的底物或者模板是足夠的，但是，如果質粒DNA用於測序則需要進一步純化。
1. 試劑
鹼裂解液I：50mM Glucose，25mM Tris-HCl pH 8.0，10mM EDTA pH 8.0，滅菌後4℃保存，使用時置於冰上；
鹼裂解液II：200mM NaOH，1% SDS（w/v），現用現配，於室溫下使用；
鹼裂解液III：3M Potassium acetate，11.5% Glacial acetic acid，4℃保存, 使用時置於冰上;
精氨酸緩衝液：0.1mM，pH 12.4，可用pH 12.4的5M NaOH調pH；
乙醇：70%，90%；
酚：氯仿：異戊醇：25:24:1（V/V）；
STE：10mM Tris-HCl pH 8.0，100mM NaCl，1mM EDTA pH 8.0，滅菌後4℃保存，使用時置於冰上；
Tris-EDTA（TE）pH8.0：100mM Tris-HCl pH 8.0，10mM EDTA pH 8.0，使用時加入RNase A使終濃度20μg/mL。
2. 設備
細菌搖床，37℃
KimWipes紙巾
3. 方法
a) 挑轉化後的單克隆菌落，接種到2mL含有適當抗生素的培養基中，於37℃劇烈振蕩過夜。此步驟需要注意的是要確保培養物通氣良好，因此培養基體積不能超過試管的1/4，並且試管蓋不能蓋緊。另外細菌培養不要超過16小時，否則細菌會崩潰，引起細菌大量死亡，導致質粒丟失。
b) 將1.5mL培養物倒入微量離心管，剩餘培養物可以儲存在4℃，用微量離心機在4℃以最大轉速（≥12000g）離心30s，離心完成後，儘快吸去上清，這個過程要避免接觸細菌沉澱。並且盡最大可能吸乾培養液，例如管壁上殘餘的液滴也可以用短暫離心後用吸頭吸去。如果未除盡培養液可能導致質粒不能被限制性酶切或不能完全切割，這是因為細胞壁成分能抑制多種限制酶的活性。尤其是在做質粒中抽或者大抽時這個問題很有可能出現，這個時候可通過用預冷的STE（離心用菌液體積的0.25倍）重懸細菌沉澱並離心來解決。
c) 用100μL預冷的鹼裂解液I重懸細菌沉澱，可以將兩個微量離心管的管底互相接觸同時渦旋振蕩，這樣可以提高細菌沉澱重懸的速度和效率，菌體一定要懸浮均勻，不能有結塊。鹼裂解液I中的葡萄糖作用是使懸浮後的大腸桿菌不會再次快速沉積到管子的底部。而EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，用來螯合大腸桿菌細胞中的所有二價金屬離子以及抑制DNase'的活性。
d) 加入200μL新鮮配製的鹼裂解液II於每管細菌懸液中，蓋緊管口，輕柔顛倒離心管5次，確保離心管的整個內壁均與鹼裂解液II接觸，以混合內容物，這個過程切勿振蕩！之後將離心管放置在冰上。此步驟所用的鹼裂解液II必須是新鮮配製，避免NaOH吸收空氣中的CO2減弱了鹼性，這也是很多商品化試劑盒的Solution II要求使用後儘快蓋上蓋子的原因。NaOH是最佳的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了鹼都會幾乎在瞬間就溶解，這是由於細胞膜發生了從bilayer (雙層膜)結構向 micelle (微囊)結構的相變化所導致。另外鹼裂解這個過程時間不能過長，因為在鹼性條件下基因組DNA會慢慢斷裂，以及劇烈震蕩也會導致基因組DNA的斷裂，這都會對之後的實驗帶來麻煩。除了斷裂的基因組DNA之外，長時間暴露在鹼性環境中超螺旋DNA還會出現不可逆的變性，產生環狀捲曲DNA，這類DNA不能被限制酶切割。
bilayer結構和micelle結構
e) 加入150μL用冰預冷的鹼裂解液III，蓋緊管口，反覆數次顛倒，使溶液III在黏稠的細菌裂解物中分散均勻，之後將管置於冰上3~5min。鹼裂解液III加入後就會有大量的沉澱，這是先由d）步驟中加入的SDS與蛋白質結合，再由e）步驟中的鉀離子置換SDS（Sodium dodecyl sulfate）中的鈉離子變成了十二烷基硫酸鉀(Potassium dodecyl sulfate，PDS)，而PDS是水不溶的，因此發生了沉澱。另外基因組DNA由於本身很長也一起被PDS共沉澱了，但是如果基因組變成了50-100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共沉澱了，所以鹼裂解液III中的醋酸是為了中和NaOH，避免長時間的鹼性條件打斷DNA。這堆沉澱除了基因組DNA和蛋白質，還有大分子量RNA、細胞壁複合物等。
SDS結合蛋白質
f) 用離心機於4℃以最大轉速（≥12000g）離心5min，將上清轉移至另一離心管中。這個步驟可能有無法形成緊密沉澱，這個一般是加入鹼裂解液II時沒有充分混勻造成，可以用20000g再次離心15min。
g) 加等量體積的酚：氯仿：異戊醇，振蕩混合有機相和水相，然後用離心機於4℃以最大轉速（≥12000g）離心2min。將上清轉移至另一離心管中，在吸取上清的時候注意不要吸到中間層，寧可少吸取一些。此步驟在很多商品化試劑盒中被省略了，但是在需要高質量質粒的實驗中或者做中抽和大抽後建議加上這個步驟，一是雖然SDS能帶走大量的蛋白質，但是並沒有完全去除，這些殘餘的蛋白質會影響之後的酶切或者其他實驗，二是這些蛋白中可能混有DNase，因此想要或者穩定高質量的質粒這個步驟不能缺少。酚能最大程度的將蛋白質去掉，但是由於酚微溶於水中，因此需要加入氯仿來去除掉水相中殘留的酚。至於異戊醇其作用是為了降低表面張力，減少氣泡的產生，並且異戊醇有助於分相，維持離心後上層含 DNA 水相、中間層變性蛋白相、下層有機溶劑相的穩定分層。
h) 加入2倍體積的乙醇，振蕩混合，置於室溫2min後用離心機於4℃以最大轉速（≥12000g）離心5min，收集沉澱的核酸。對於這種微量沉澱的離心，最好養成總是用同一種方式在離心機中放置離心管的習慣。例如，按順序放置，將離心管的塑料柄朝外，這樣沉澱總是在離轉頭中心最遠的離心管內壁聚集，也就能知道DNA沉澱在什麼位置便於找到可見的沉澱，也可以看不見沉澱的情況下避開沉澱吸去上清。此外在離心管的側面和頂部做好標記，這樣即使字跡模糊了也能辨識。
i) 按上述步驟吸去上清液，將離心管倒置在KimWipes紙巾上，以使所有的液體排乾，或者再次短暫離心後用吸頭除去原本掛在管壁上的液滴。
j) 加1mL 70%的乙醇於沉澱中並將蓋緊的試管顛倒數次以讓沉澱漂浮起來，用微量離心機在4℃以最大轉速離心2min，吸去所有上清並再次短暫離心後用吸頭除去原本掛在管壁上的液滴。
k) 打開試管的蓋子置於室溫揮發乙醇，5~10min，直至試管內沒有可見液體存在。這個過程不可時間過長，會導致DNA脫水而難以溶解並可能變性。
l) 用50μL含有20μg/m去DNA酶的RNase A的TE（pH8.0）重新溶解核酸，溫和振蕩幾秒，可儲存於-20℃。這個步驟需要根據後續實驗需要來選擇最後溶解的液體，如果後續只是作為PCR，這樣溶解即可；如果是用於酶切反應則最後可以用Tris-HCl來溶解；如果是用於轉染以及體外轉錄實驗則最好使用五核酸酶的水來進行溶解。