分子實驗查漏補缺系列:利用酚:氯仿:異戊醇分離純化DNA

1.將樣品轉移至EP管中，加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇；

2.混勻管中內容物，直到呈現乳狀液形式。此處需要注意的是在分離小分子DNA分子時（＜10kb）可用渦旋方法將有機相和水相進行混合。但當分離中DNA為10-30kb時，應輕柔振蕩。當分離大分子質量DNA（＞30kb）時，需要旋轉器上輕柔晃動管（20r/min）使有機相與水相混合，避免DNA被切斷。

3.在室溫條件下，12000g離心，15min；

4.使用移液器將上層水相轉移至新的EP管中，寧可少吸點也要避免吸到中間層。如果DNA量少，想要提高回收效率可以轉移上清之後補上相同體積的TE，重複2-4步驟；

5.按照吸取的上清體積估算乙酸鈉（3.0mol/L,pH 5.2）用量，使得終濃度為0.3mol/L。針對小片段和低濃度的DNA分子，最好使用乙酸銨（終濃度500mmol/L）而不是乙酸鈉用於平衡離子，可以抑制形成鹽沉澱物；

6.加入2倍體積的冰乙醇或0.6-0.7倍體積的異丙醇，充分混勻後靜置於冰上13-30min，讓DNA沉澱形成。與通常認為的不同，低溫可抑制DNA的沉澱生成，室溫條件下發生沉澱的效率較大,而不是-20℃或者-80℃。最小反應時間取決於DNA的長度和濃度，長度越短、濃度越低的DNA分子沉澱需要進行更長的時間。如果DNA的片段很小時（＜100個核甘酸）或者當DNA的量很少時（＜0.1ng/mL）,推薦4℃過夜反應並且加入終濃度為0.05-1mg/mL的糖原；

7.用低溫離心機於4℃，12000g離心30min。小心地用移液器吸取上清至新的EP管，避免吸到DNA沉澱，如果管壁上殘留有液體可以再次短暫離心後用移液器吸去。注意保存上清，直到最後溶解DNA後有合適的濃度才可以棄去上清；

8.加入一半體積的70%乙醇，輕彈EP管底部，使沉澱漂浮起來，於4°C，12000g離心5min，小心吸去上清；

9.室溫下，將敞口的管置於工作檯上直到殘留的液體揮發完為止，這個過程大約2-5min。不要用烘箱乾燥，或者乾燥時間過久，否則DNA過分乾燥難以溶解；

10.用適量的TE緩衝液（pH 8.0）溶解DNA沉澱。