真菌的DNA和RNA提取方法

2020-12-03 食品檢驗員培訓網

一、真菌DNA的提取(方法一)

1.實驗試劑

(1)DNA提取液:0.2M Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,0.01M EDTA,1％SDS

(2)3M NaAc

(3)TE:10 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1 mmol/L EDTA

(4)酚(pH8.0):氯仿:異戊醇(25:24:1)

(5)氯仿:異戊醇(24:1)

(6)異丙醇

(7)無水乙醇

(8)75%乙醇

(9)RNaseA

2.實驗步驟

(1)取真菌菌絲0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉

(2)加入4mL提取液,快速振蕩混勻

(3)加入等體積的4mL的氯仿:異戊醇(24:1),渦旋3～5min(此處是粗提沒有加酚,可以節約成本)

(4)1000rpm,4℃,5min

(5)上清用氯仿:異戊醇(24:1)再抽提一次(10,000rpm,4℃離心5min)

(6)取上清,加入2/3倍體積的-20℃預冷異丙醇或2.5倍體積的無水乙醇沉澱, 混勻, 靜置約30 min

(7)用毛細玻棒挑出絮狀沉澱,用75%乙醇反覆漂洗數次,再用無水乙醇漂洗1次,吹乾,重懸於500ul TE中

(8)加入1ul RNaseA (10mg/mL),37℃處理1h

(9)用酚(pH8.0):氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃離心5min)

(10)取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V體積的無水乙醇,-70℃沉澱30min以上

(11)沉澱用75%乙醇漂洗,風乾,溶於200ul TE中,-20℃保存備用

二、真菌DNA的提取(方法二)

1.真菌菌絲0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉

2.加入3mL 65℃預熱的DNA提取緩衝液,快速振蕩混勻65℃水浴30min,期間混勻2-3次

3.加入1mL 5M KAc,冰浴20min

4.氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃離心5min)

5.取上清,加入2/3倍體積的-20℃預冷異丙醇,混勻,靜置約30 min

6.用毛細玻棒挑出絮狀沉澱,用75%乙醇反覆漂洗數次,再用無水乙醇漂洗1次,吹乾,重懸於500ul TE中

7.加入1ul RNaseA(10mg/mL),37℃處理1h

8.用酚(pH8.0):氯仿:異戊醇(25:24:1)和氯仿:異戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃離心5min)

9.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V體積的無水乙醇,-70℃沉澱30min以上

10.沉澱用75%乙醇漂洗,風乾,溶於200ul TE中,-20℃保存備用

DNA提取緩衝液:100mM Tris-HCl(pH8.0),20mM EDTA(pH8.0),1.5M NaCl,2% CTAB(W/V),4% PVP40(W/V)和2%巰基乙醇(V/V),PVP和巰基乙醇使用前加入5M KAc

方法一和二,是大同小異.主要是DNA提取液配方不一樣！成本也不一樣！

三、真菌菌絲的總RNA的提取

1.實驗試劑

(1)RNA提取緩衝液(CTAB):2% CTAB(W/V),2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP(W/V),100mM Tris-HCl(pH8.0,DEPC處理的水配置),25mM EDTA,0.5g/L 亞精胺Spermidine,2.0M NaCl,2%巰基乙醇(V/V,使用前加入).由於在高溫滅菌條件下,Tris-HCl要和DEPC發生反應,所以配RNA提取緩衝液時直接用DEPC 處理的水配製即可

(2)SSTE:1 M NaCl,0.5% SDS(W/V),10mM Tris-HCl pH8.0,1.0mM EDTA

(3)10M LiCl 直接用蒸餾水配10M LiCl,加1‰的DEPC過夜後,高溫滅菌

(4)3M NaAc

(5)氯仿:異戊醇(24:1)

(6)酚(pH4.5):氯仿:異戊醇(25:24:1)

(7)DEPC處理水 用1‰的DEPC處理蒸餾水過夜,高溫滅菌

(8)無水乙醇;70%酒精

2.實驗步驟

(1)實驗開始前將RNA提取液於65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)

(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻

(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次

(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5):氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(5)取上清,等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)

(7)10,000rpm,4℃離心20min

(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉澱

(9)酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提兩次,氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉澱30min以上

(11)12,000rpm,4℃離心20 min

(12)棄上清.沉澱用70%酒精漂洗一次,乾燥

(13)加200ul的DEPC處理水溶解

(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)

注意：提取RNA請儘量在低溫下操作,如果條件不容許,在室溫下操作的時間要儘可能的短.

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