植物基因組DNA及總RNA提取技術

2020-11-24 生物谷

幼嫩組織的細胞處於旺盛的分裂階段,核較大而胞質較少,核酸濃度高,且內含物少、次生代謝產物少,蛋白質及多糖類物質相對較少,在SDS或 CTAB物質存在時,經機械研磨,使細胞破裂並釋放出內含物,提取的DNA、RNA的產量高,純度好。
提取DNA所用的提取液、吸頭、離心管等需要高壓滅菌以滅活DNase。RNase存在於所有的生物中,並且耐沸騰、蒸煮,所以在提取RNA的過程中要防止RNA酶汙染,用具如吸頭、離心管、水、藥品等都要經RNase的抑制劑DEPC處理,即每100mL溶液中加入0.1~0.2 mL DEPC溶液,37℃過夜,然後高壓滅菌20 min以滅活DEPC。由於RNA容易降解,所有的提取步驟都在冰浴中進行。
DNA(RNA)定量分析可用紫外光譜分析,原理是DNA(RNA)分子在260 nm處有特異的紫外吸收峰,且吸收強度與DNA(RNA)的濃度成正比。此外,還可通過瓊脂糖凝膠電泳上顯示的DNA(RNA)帶的亮度來分析,因為EB作為一種螢光染料,能插入DNA(RNA)的鹼基對平面之間而結合於其上,在紫外光的激發下產生螢光,DNA(RNA)分子上EB的量與DNA分子的長度和數量成正比。在電泳時加入已知濃度的DNA(RNA)Marker作為DNA(RNA)分子量及濃度的參考,樣品DNA(RNA)的螢光強度就可以大致表示DNA(RNA)量的多少。這種方法的優點是簡便易行,可結合瓊脂糖凝膠電泳分析DNA(RNA)樣品的完整性來進行,缺點是不太準確。
本實驗介紹植物DNA、RNA提取及檢測的方法步驟。
一、試材及用具
試材:植物幼嫩組織(如幼葉、花器、幼根)。
儀器、用具:離心機、離心管、紫外分光光度計、微量移液器、吸頭、吸水紙、水浴鍋、冰箱、研缽、液氮罐、電子天平、pH計、高壓滅菌鍋、一次性手套和口罩、電泳儀、電泳槽等。
需配置的藥品和緩衝液:
提取DNA緩衝液(CTAB法): 2% CTAB(W/V),100 mmol/L Tris-HCI pH 8.0, 20 mmol/L EDTA pH 8.0, 1.4 mol·L-1 NaCl,2% PVP (滅菌後加入2% PVP ,使之充分溶解)。在研磨葉片前加入1%(V/V)ß-巰基乙醇。
CTAB提取RNA緩衝液為:2% CTAB(W/V),2% PVP(W/V),25 mmol/L EDTA,100 mmol·L-1 Tris-Cl pH 8.0,2.0 mol·L-1 NaCl, 0.5 g·L-1 Spermidine(亞精胺)。滅菌後加入2%(V/V)ß-巰基乙醇。
SSTE buffer為:1.0 mol/L NaCl,0.5%SDS,10 mmol/LTris-Cl pH 8.0,1 mmol/L EDTA。
TE(pH 8.0): 稱取1.211 g Tris、0.372 g EDTA-Na2 ,先用800 mL蒸餾水加熱攪拌溶解,用鹽酸調pH 8.0,再用蒸餾水定容至1000 mL。高壓滅菌20 min。
氯仿/異戊醇(24:1,v/v): 將氯仿和異戊醇按體積24:1的比例混勻,置棕色瓶中,4℃保存。
酚: 氯仿:異戊醇(25:24:1):按飽和酚、氯仿、異戊醇體積比為25:24:1比例混勻,置棕色瓶中,4℃保存。
5× RNA電泳緩衝液的配製:依次加入以下成分: 10.46 g MOPS 、1.7 g乙酸鈉,0.93 g EDTA,調pH 7.0,定容到500 mL。
RNA 加樣緩衝液:1 mmol/L EDTA pH 8.0、0.25% 溴酚藍、0.25%二甲苯青、50%甘油,高壓滅菌。
二、方法步驟
(一)植物基因組DNA提取
在提取過程中用到的吸頭、研缽、提取緩衝液等先高壓滅菌20 min,取出後待用,按照下述步驟提取基因組DNA
(1)在65°C水浴中預熱CTAB提取液。
(2)在液氮中研磨2~3 g新鮮或 -20°C冷凍的樣品材料。注意,要研成很細的粉末,動作要快。
(3)迅速加入CTAB提取液,混勻,倒入離心管中,65°C水浴30 min。其間不斷輕輕搖動離心管。
(4)加入5mol/L的乙酸鉀充分混勻,在冰浴中放置30 min中,4°C 12000 rpm離心5 min,吸上清。
注意,對於幼嫩葉片此步可以省略。對成熟的老葉片需採用。
(5)加入等體積的氯仿/異戊醇,混勻,放置10 min,12000 rpm常溫離心10 min。
(6)吸上清到新離心管中,用氯仿/異戊醇重複抽提一次。
(7)吸上清到新離心管中,加入2.5倍體積的無水乙醇,混勻,-20°C放置10~30 min沉澱DNA
(8)10000 rpm常溫離心10 min。
(9)倒掉乙醇,用400 μL70%乙醇洗沉澱,然後用400μL100%乙醇洗沉澱,吹乾後用200~500 μL TE溶解DNA
(10)溶解後的DNA再用氯仿/異戊醇抽提一遍.
(11)吸上清到新離心管中,加入2.5倍體積的無水乙醇,混勻,-20°C放置10~30 min ,沉澱DNA
(12)離心,棄上清,70%乙醇洗沉澱,再用100%乙醇洗沉澱,吹乾後,用200 μLTE 溶解DNA。用紫外分光光度計測定濃度後,按要求的濃度(如200 μg·μL-1)再向DNA溶液中加入適量TE。在 -20°C冰箱中可長期保存。
注意,提取的DNA的質量由它的長度和純度決定。輕輕操作DNA溶液和快速冷凍植物組織對減輕機械剪切力和核酸酶切割非常重要,不能振蕩,不能使用太細口的吸頭,也不能吸得太快。多糖、蛋白質及木本植物中的酚類物質是植物DNA抽提中的主要汙染物,提取材料要儘量使用幼嫩葉片。如果試材較老、多糖含量高,在提取緩衝液中應提高ß-巰基乙醇的用量,且在用氯仿/異戊醇抽提之前先用酚: 氯仿:異戊醇抽提一遍,這樣去除蛋白較為徹底。所得DNA應為無色或灰白色,若呈褐色則有多酚類物質汙染;對多糖含量高的材料,提取液中CTAB的濃度可增至3%或更高。
瓊脂糖電泳檢測DNA:
製作1%的瓊脂糖凝膠,吸取提取的DNA溶液 5 μL,電泳檢測,具體方法見實驗47。用λDNA做分子量大小的Marker,如果帶型不彌散,在與Marker 20 kb的帶的相應位置出現整齊明亮的條帶,說明基因組DNA完整,沒有降解。

(二)植物總RNA提取
(1)65°C水浴中預熱15 mL CTAB提取液。
(2)液氮中研磨2~3 g新鮮或-70°C冷凍的材料。
(3)轉移樣品至有CTAB提取液的離心管中,立即激烈渦旋30s,短時放回 65°C水浴中(4~5 min)。
(4)加入等體積的氯仿/異戊醇並渦旋混合,10000 rpm常溫離心15 min。
(5)將上清轉移至一新離心管。重複抽提一次。
(6)將上清轉移至一新離心管中,加入8 mol/L LiCl, 使LiCl的終濃度為2 mol·L-1,即加入1/3體積的LiCl,4°C下沉澱過夜(最多16h)。
(7)4°C離心1 h(全速),棄上清,用500 μL70%乙醇洗沉澱,然後用500 μL100% 乙醇洗沉澱。
(8)用500 μL SSTE 溶解沉澱,轉移至1.5 mL離心管中,加入等體積的氯仿/異戊醇抽提一次。
(9)加入2×體積的無水乙醇,在-70°C沉澱30 min或-20°C沉澱2 h。
(10)4°C離心20 min沉澱RNA(全速)。
(11)先用400 μL70%乙醇洗沉澱,然後用400 μL100%乙醇洗沉澱,吹乾後用65 μLDEPC水溶解RNA。

電泳檢測RNA:
(1)配製1.2%的瓊脂糖凝膠(20mL)
稱取瓊脂糖0.24 g,加DEPC處理的ddH2O 12.04 mL,5×RNA 電泳緩衝液4 mL,電爐加熱融化瓊脂糖,冷卻至55°C,加入甲醛1.96 mL,冷卻後倒膠。
(2)RNA電泳
取去離子甲醯胺10 μL,甲醛1.5 μL,10× RNA Buffer 2 μL,RNA (2~4 μg, <10 μL) 混合液,65°C加熱15min,迅速在冰浴中冷卻片刻,然後加入3 μL RNA 加樣緩衝液和0.5 μL EB,上樣電泳電泳Buffer 為1× RNA buffer。
出現的電泳條帶有兩條,是兩條最大的核糖體RNA(rRNA)分子,即18S 和28S rRNA,較小的RNA也很豐富但看不到,因為太小,跑出了凝膠的邊界。多數細胞中的信使RNA(mRNA)經EB染色後不足以形成可見的帶。只要18S 和28S rRNA帶亮,且28S rRNA大約為18S rRNA 的兩倍,說明提取的RNA沒有發生降解,純度好。
RNA提取有其他多種方法,整個流程下來所用時間不同,如專門的試劑盒Trizol可在1.5h內完成RNA的提取工作,但得率較低,適合草本類植物,木本類植物用CTAB法提取的RNA可在1.5d內完成,但得率高,此法可獲大量的RNA用於Northern雜交、基因克隆等工作。
(三)提取的DNA(RNA)的濃度檢測
(1)取少量待測DNA(RNA)樣品,用TE或蒸餾水稀釋50倍(或100倍)。
(2)用TE或蒸餾水做空白,在260 nm、280 nm、310 nm處調節紫外分光光度計的讀數至零。
(3)加入待測DNA(RNA)樣品在三個波長處讀取OD值。
(4) 純DNA樣品的OD260/OD280 大約為1.8,高於1.8可能有RNA汙染,低於1.8有蛋白質汙染;純RNA 樣品的OD260/OD280 大約為2.0。
(5)根據OD值計算DNA(RNA)濃度或純度。
[SSDNA]=33×(OD260-OD310)×稀釋倍數
[dSDNA]=50×(OD260-OD310)×稀釋倍數
[SSRNA]=40×(OD260-OD310)×稀釋倍數
三、作業思考題
1.提取DNA、RNA之前為什麼要先進行高壓滅菌?
2.提取DNA、RNA的步驟主要有哪些?需要注意哪些問題?
3.如何檢測、評價提取的DNA、RNA的質量?
4.如何確定提取的DNA、RNA的濃度?

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