RNA提取實驗方法

2020-11-24 生物谷

RNA提取實驗方法

來源：小木蟲論壇 2006-12-09 20:53

總RNA（total RNA）和信使RNA(mRNA)的抽提（自己的總結）

1、實驗目的
提取人體細胞的總RNA和mRNA。

2、本實驗所需試劑
1）、CNE-2細胞及培養細胞的一系列條件，
2）、PBS緩衝液， TRIZOL試劑，
3）、DEPC處理過的水、大、中、小Tip及1.5 ml EP管,
4）、新的氯仿、異丙醇和乙醇，
5）、mRNA分離試劑盒：Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN。
6）、新配的電泳緩衝液，專跑RNA的瓊脂糖（Agarose）。

3、實驗流程(掌握內容)
3.1 細胞總RNA的提取
1）、6孔板細胞（CNE-2）匯合度為90-100%時，取出無菌室，去其上清，用PBS洗兩次後，每孔加TRIZOL試劑（Gibco公司） 1 ml，搖勻，無菌罩內消化3-5分鐘（觀察：液體變粘稠，細胞脫壁）。
2）、將各孔內消化好的細胞裂解液吸到一DEPC處理過的1.5 ml EP管中，加新開的氯仿0.2 ml，輕搖15秒。
3）、室溫靜置2-3分鐘後，12000 rpm，15 min，4℃，離心。然後取上清無色水相（約0.6 ml）到 EP管（DEPC處理過），加0.5 ml新開的異丙醇，室溫下靜置10分鐘。
4）、12000 rpm，10分鐘，4℃，離心。觀察總RNA在管底的白色沉澱，棄去上清（小心別丟了沉澱），75%乙醇1.0 ml洗滌（用DEPC水新配製）後，7500 rpm，5 min，4℃離心。
5）、去上清，點離，用小Tip吸乾液體。氣幹沉澱5-10分鐘， DEPC處理水20-30 ul加入，中槍打勻，55-60℃水浴10分鐘溶解總RNA，測OD值。
6）、電泳。

3.2 從總RNA中分離mRNA（Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN）
1）、取上述提取的總RNA若干（少於0.25 mg）到一個新的無RNase 的EP管中，用無RNase的水定容到250 ul。
2）、加入Buffer OBB 250 ul, Oligotex Suspension 15 ul。用Tip打勻或用手彈勻。
3）、70℃水浴，3分鐘（裂解RNA的二級結構）。
4）、20-30℃條件下，靜置10分鐘（讓Oligotex與mRNA結合）。
5）、高速離心2分鐘，小心吸走上清（該上清要保留），留下約50 ul的上清在原管裡。
6）、用Buffer OW2 400 ul重懸含Oligotex/mRNA複合物的沉澱，然後將這些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上，高速離心1分鐘。
7）、將SPIN柱子移到一個新的EP管上，加Buffer OW2 400 ul到柱子，高速離心1分鐘，丟掉濾過液。
8）、將SPIN柱子移到一個新的EP管上，加20-100 ul熱的（70℃）Buffer OEB到柱子上，用Tip來回吸打3-4次，高速離心1分鐘。
9）、為保證最大的 mRNA產量，可再次重複第8步。
10）、電泳。

4、mRNA的應用(了解內容)：
RT-PCR, Northern雜交，cDNA文庫構建, mRNA末端快速擴增(RACE)，差異表達(DDRT-PCR)，引物延伸反應(Primer Extension)，體外轉錄(In Vitro RNA Transcription), RNA標記(RNA labeling)，RNA酶保護試驗(RNase and S1 Nuclease Protection Assay)，RNA微注射(RNA Microinjection)

本網站所有註明「來源：生物谷」或「來源：bioon」的文字、圖片和音視頻資料，版權均屬於生物谷網站所有。非經授權，任何媒體、網站或個人不得轉載，否則將追究法律責任。取得書面授權轉載時，須註明「來源：生物谷」。其它來源的文章系轉載文章，本網所有轉載文章系出於傳遞更多信息之目的，轉載內容不代表本站立場。不希望被轉載的媒體或個人可與

我們聯繫

，我們將立即進行刪除處理。

溫馨提示：87%用戶都在

生物谷APP

上閱讀，掃描立刻下載! 天天精彩！

相關焦點

  • RNA提取實驗步驟
    本文詳細介紹RNA提取的實驗前準備及詳細實驗步驟，對於做克隆和螢光定量的同學們有所幫助！同時要時刻警惕RNA提取也做到無菌操作的水平！
  • 我們今天來提取質量好點的RNA!RNA提取實驗知識一覽
    通過總RNA提取可獲得高純度及高質量的總RNA，可用於螢光定量PCR，cDNA文庫構建，基因克隆等實驗。常用總RNA提取試劑異硫氰酸胍法和Trizol法是動物組織及動物細胞總RNA提取最常用的方法，異硫氰酸胍法操作簡單快捷，適用於樣本足夠大的常規動物組織。
  • 真菌的DNA和RNA提取方法
    一、真菌DNA的提取(方法一)1.實驗試劑(1)DNA提取液:0.2M Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,0.01M EDTA,1％SDS(2)3M NaAc(3)TE:10 mmol
  • 細菌DNA提取方法的優化
    實驗首先研究超聲時間對大腸桿菌dna提取效果的影響，其次在傳統法、水煮法、es法（傳統法+溶菌酶）、esu法（傳統法+超聲+溶菌酶）之間進行比較，分析不同提取方法提取的兩種菌株dna的濃度及純度，找出了一種準確、高效的dna提取方法，為今後生物檢測鑑定工作提供了保障。
  • DNA/RNA提取
    採用常規吸附柱法抽提樣本中的DNA、RNA，為下遊實驗提供高純度和高濃度的模板。DNA提取方法：對基因組DNA的提取方法主要有 CTAB，SDS和其他如玻璃珠法，酶法等。質粒DNA的提取主要有鹼裂解法和煮沸法；線粒體，葉綠體DNA的提取主要有差速離心結合SDS法。RNA提取方法：異硫氰酸胍/苯酚法。基本實驗原理：細胞在變性異硫氰酸胍作用下裂解，核酸釋放。
  • 提取蕨類植物蜈蚣草總RNA 的一種有效方法
    1 材料與方法1.1 實驗材料和試劑蜈蚣草(Pteris vittata L.)採自我國湖北礦區，移栽在溫室培養。取幼嫩葉片作為RNA提取材料。各種試劑均為RNA實驗專用。1.2.2 硫氰酸胍一步法提取總RNA 參考《分子克隆實驗指南》的方法(Sambrook et al., 1992)。1.2.3 TRIZOL法提取總RNA TRIZOL總RNA 提取試劑盒購於Invitrogen 公司，嚴格按照試劑盒說明書操作。1.3 RNA質量檢測用紫外分光光度計檢測RNA 純度和濃度, 用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的完整性。
  • RNA提取常見問題及注意事項
    1.RNA在細胞內極易降解，樣本選擇時一定要選取新鮮的樣本組織或者取樣後迅速低溫處理（液氮速凍）；樣本出現多次反覆凍融後，RNA得率會嚴重下降，也會導致RNA降解；RNA提取環境要保持無RNA酶汙染；　　2.RNA容易受到環境汙染導致RNA嚴重降解，建議實驗過程中注意更換實驗手套，使用所有耗材應該均無RNA酶的一次性耗材；
  • 實驗設計策略(一):RNA轉錄的實驗方法選擇和步驟
    他們在初始接觸分子實驗時，手持《現代分子生物學實驗指導》這本寶典，很容易被五花繚亂的實驗方法亂了陣腳······作為新人，自然選擇前者，因為經打聽和查資料後我發現，RNA轉錄使用實時螢光定量PCR（qPCR）方法就好，容易上手出結果快，而對比蛋白質表達水平的Western Blot（WB），在抗體成本和摸索實驗體系的時間成本上都不合算（當然，很多實驗中如果RNA轉錄水平出現差異，還是很有必要在蛋白水平進行驗證的，這個我們會在以後的文章中詳述）。
  • 小麥總RNA的提取實驗
    實驗步驟 實驗原理 1所有容器高溫滅菌兩次，DEPC高溫滅菌，所有的試劑用DEPC配製，高溫滅菌。 去除RNA酶（外源）的影響。 高溫滅菌兩次可以破壞RNA酶的復性過程.雖然RNA酶極易復性，但兩次連續的高溫會打亂它的復性歷程，從而使RNA酶失活。 DEPC是RNA酶的非競爭性抑制劑。
  • 植物基因組DNA及總RNA提取技術
    這種方法的優點是簡便易行，可結合瓊脂糖凝膠電泳分析DNA(RNA)樣品的完整性來進行，缺點是不太準確。本實驗介紹植物DNA、RNA提取及檢測的方法步驟。一、試材及用具試材:植物幼嫩組織（如幼葉、花器、幼根）。
  • 淨信多樣品組織研磨儀:研磨提取樹枝內微生物
    客戶：浙江大學—-劉常利博士　　　　研究方向：真菌多樣性與真菌病害　　　　實驗目的：根莖土壤內微生物研磨，本次實驗對象為微生物，要求與土壤一起磨　　實驗步驟：　　　　1、準備Tissuelyser-48一臺、鋼罐一套以及所需研磨樣品若干。　　　　2、取適量樣品、一顆研磨珠一起放入鋼罐中，蓋子旋上。　　　　3、將配備好的鋼罐放入液氮中預冷，凍脆樣品。
  • 一種快速鑑定RNA 質量的方法
    方法　在常規瓊脂糖凝膠電泳的基礎上,結合甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳加以改進而成。結果　提取的總RNA 用此方法電泳後可得到28S、18S、5. 8S(5S) 三條清晰的rRNA 條帶。結論　此方法可以達到對RNA 完整性進行快速鑑定的目的。　隨著分子生物學技術的迅猛發展及在醫學領域中的普及,以RNA 為研究對象的實驗與日俱增。RNA 質量的好壞直接關係到後續實驗的成敗。
  • RNA-XPress 快速提取試劑
    RNA-XPress 快速提取試劑 RNA-XPress Reagent 獲得的RNA可用於下遊的Northern Blot、mRNA分離、體外翻譯、RT-PCR、核酶保護實驗等 原理 RNA-Xpress為硫氰酸胍和苯酚的單相混合液，能有效溶解RNA。加入氯仿並離心後，溶液分為3相，水相含RNA，中間相含DNA，有機相含蛋白質。
  • 實驗設計+實驗方法+作圖一個都不落!
    在醫學科研中，進行具體實驗前必須進行實驗設計，包括如何分組、怎樣合理估計各處理組(處理組合)中樣本例數、如何非處理因素等方面。不管是什麼實驗，對照、隨機與重複是實驗設計中必須遵循三大原則。實驗方案確定以後就要確定具體實驗了。今天給大家介紹的是Western blot ，基礎科研中最最最常見的實驗之一，雖然操作步驟繁瑣，條帶分析複雜，實驗難度高，但是使用範圍還是很大的。
  • 低溫冷卻液循環泵對於提取金銀花綠原酸實驗的重要性!
    京華儀器生產的低溫冷卻液循環泵憑藉出色的製冷性能，在多變的實驗環境下，可以與多種實驗設備組成配套使用，為其提供恆流恆壓的超低溫冷卻循環水，既可以提供低溫實驗環境，還可以作為設備發熱部件的降溫工具使用，加速整個實驗的效率。
  • RNA提取常見問題分析
    RNA提取常見問題分析 來源：來源網絡 2007-08-19 18:49 柱子堵塞： 1.
  • 實驗證明可以從黑洞中提取能量
    ，現在，這一理論終於得到了實驗驗證。物理學家通過對所需組件的模擬，證明彭羅斯機制確實是可行的，如果我們能夠開發出適當的方法的話，可以將黑洞中的一些旋轉能量提取出來。黑洞是狂野的。但在1971年，蘇聯物理學家雅可夫·澤爾多維奇提出了一個更實用的實驗：用一個旋轉的金屬圓柱體代替黑洞，然後向它發射扭曲的光束。如果圓柱體以合適的速度旋轉，光就會被反射回來，並從圓柱體的旋轉中提取額外的能量，這是由於一種叫做旋轉都卜勒效應造成的。
  • 環境微生物基因組DNA的提取——萬融實驗
    【實驗目的】（1）掌握溶菌酶—CTAB—蛋白K—凍融法提取土壤微生物基因組DNA的原理。（2）掌握採用溶菌酶—CTAB—蛋白K—凍融法提取土壤微生物基因組DNA的方法及操作過程。（3）熟練掌握瓊脂糖凝膠電泳的操作過程。
  • RNA pull down實驗技術
    RNA pull-down是檢測RNA結合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實驗手段之一。
  • 關於從COD廢液中提取白銀的方法!
    關於從COD廢液中提取白銀的方法！北極星水處理網訊:在COD的國標法中，硫酸銀作為必備的催化劑，所以COD廢液中含有銀離子，提取後有一定的經濟價值，但主要是好玩，才會想出這個辦法，也是我們俗稱的銀氨法。