實驗設計策略(一):RNA轉錄的實驗方法選擇和步驟

2021-01-19 解螺旋



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編譯：解螺旋.麥子

如需轉載請註明來源：解螺旋·醫生科研助手


正規化管理的實驗室都會給新人進行相關技能體系的培訓，但是被老闆散養的研究僧或者無奈從0開始做科研的臨床醫生也不在少數。他們在初始接觸分子實驗時，手持《現代分子生物學實驗指導》這本寶典，很容易被五花繚亂的實驗方法亂了陣腳······



連轉錄和反轉錄都不太搞得清楚的科研新人如何根據自己的實際情況各取所需呢？首先，明確自己的定位，你目前要解決的是單個問題而不是一口吃成一個大胖子，然後關鍵是明確實驗對象和實驗目的。


舉個慄子，我現在手頭上的樣本是某個類型腫瘤臨床患者切除的組織，我的目的是檢測這些樣本與正常組織樣本中幾個「明星分子（如P53等與癌症密切相關的分子）」是不是有差異表達，我該怎麼做？

根據我的實驗目的，我最後一步的實驗其實已經確定了，就是從分子層面比較不同樣本中幾個基因的表達，但是分子層面可以是RNA轉錄水平，也可以是蛋白質表達水平。作為新人，自然選擇前者，因為經打聽和查資料後我發現，RNA轉錄使用實時螢光定量PCR（qPCR）方法就好，容易上手出結果快，而對比蛋白質表達水平的Western Blot（WB），在抗體成本和摸索實驗體系的時間成本上都不合算（當然，很多實驗中如果RNA轉錄水平出現差異，還是很有必要在蛋白水平進行驗證的，這個我們會在以後的文章中詳述）。

所謂qPCR技術，是指在PCR反應體系中加入螢光基團，利用螢光信號積累實時監測整個PCR進程，最後通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。該技術實現了PCR從定性到定量的飛躍，它以其特異性強、靈敏度高、重複性好、定量準確、速度快、全封閉反應等優點成為了分子生物學研究中的重要工具。



PCR技術整體圖示

從最後一步實驗往前推，qPCR需要哪些基本的元素？具體如下：

qPCR的模板→當然不能直接用腫瘤組織和正常組織→查資料發現模板是cDNA→怎麼製備cDNA？→提取所有組織樣本的RNA進行反轉錄（逆轉錄-聚合酶鏈式反應，RT-PCR）→我需要RNA抽提試劑盒和反轉錄試劑盒→完成RNA的提取和cDNA的合成（放心，試劑盒裡都會有非常具體的操作說明書，但是自己要多查資料了解原理，不然你和流水線操作員何異？）

qPCR的引物→根據已經確定的分子自己使用引物設計軟體設計或者查找文獻找到經過驗證的引物，具體方法可以點擊連結（乾貨 | 簡單粗暴的qPCR引物設計）查看，不要忘了GAPDH或者其他內參的引物

SYBR® GREEN→商業試劑盒

酶→包含在SYBR® GREEN試劑盒中

RNase-free H2O→一般在SYBR® GREEN中會有對應的H2O，小夥伴們千萬不要使用正常PCR中使用的高溫滅菌H2O，否則溶解曲線讓你分分鐘想撞牆。

根據SYBR® GREEN試劑盒說明書中的體系要求完成實驗操作（冰上操作）和對qPCR儀器的設置，具體儀器的使用方法一定要多多問別人，最後得出的數據怎麼處理？可以點擊這篇文章（讀圖 | qPCR那些奇奇怪怪的曲線都代表啥？）查看。

下期預告：有了差異表達的分子怎麼選擇實驗進行功能性驗證？


61：非編碼RNA類型及功能匯總，吐血推薦！

62：一文讀懂 | 與自噬相關的mTOR信號通號

63：乾貨 | Oligo設計引物，就是這麼簡單

64：跟著13分文章學作圖，等著收穫SCI吧（origin8教程）

65：乾貨 | 磷酸化抗體使用必殺技 

66：Discussion寫作模板：從3分、5分到10分

67：一文包會：Web of science資料庫應用寶典

68：讀圖 | qPCR那些奇奇怪怪的曲線都代表啥？

69：MicroRNA，如何實現從零基礎到10分的跨越

70：ELISA實驗操作中值得關注的細節大盤點

回復SCI、國自然、信號通路、CNS、實驗工具、統計查看相應專欄文章！

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