Southern blot實驗方法與步驟

2020-12-04 生物谷
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Southern blot實驗方法與步驟

來源：來源網絡 2007-06-25 21:36

用於檢測重組DNA，也可分析DNA樣品中是否有與探針序列同源的DNA片段。用於基因診斷，也可驗證檢測片段的分子量大小。將基因組DNA經限制性內切酶酶切，進行瓊脂糖電泳，把分離後定位在凝膠上的不同分子量的DNA經鹼變性處理，將凝膠中變性的DNA轉移至一固相支持濾膜。利用標記的某一DNA、RNA或寡核苷酸與固著於濾膜上的DNA發生同源性雜交，利用放射自顯影（化學發光法或顯色法）檢測。
（一） 器材：臺式離心機，恆溫水浴鍋，電泳儀，水平電泳槽，雜交爐，雜交袋，尼龍膜或硝酸纖維素膜，轉印跡裝置，濾紙，吸水紙，紫外交聯儀或80℃烤箱，搖床，X線膠片。
（二） 試劑：限制性內切酶，DNA加樣緩衝液，DNA Ladder Marker，0.25M HCl，變性液（0.5M NaOH，1.5M NaCl），中和液（0.5M Tris- HCl PH7.5，3M NaCl）, 轉印跡液20╳SSC（3M NaCl，0.3M檸檬酸鈉，PH7.0），標記探針， 2╳SSC，預雜交液和雜交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）,0.5×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS),1×緩衝洗液（0.1M馬來酸，0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20）,1×封阻液[1％(W/V)封阻劑溶於1×馬來酸溶液（0.1M馬來酸，0.15M NaCl ,PH7.5）]，1×檢測液（0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5），抗－地高辛－鹼性磷酸酶。

注意：若基因組DNA過低，要以較大體積進行限制酶消化，消化完畢後，可以通過乙醇沉澱、濃縮DNA片段，加少量DNA加樣緩衝液點樣。
2、 消化好的樣品點樣於0.7％瓊脂糖凝膠進行電泳；
注意：為保證DNA均勻分散於加樣孔，應緩慢將樣品加至加樣孔。
3、 電泳結束後，將凝膠依次用如下試劑處理進行鹼變性，室溫下輕輕搖動確保溶液覆蓋凝膠 0.25M HCl 10－15 min
蒸餾水搖洗 5 min
變性液 40 min
蒸餾水搖洗 5 min
中和液 15 min，2次；
4、 在凝膠鹼變性的同時，製備轉印跡裝置。Southern blot轉膜技術有三種：1），毛細管轉移法；2），電轉移法；3），真空轉移法。這裡介紹最經典的毛細管轉移法（向上轉移），在轉印跡槽中，倒入20╳SSC溶液，槽中置一固相支持物，在固相支持物上從下向上依次置入：兩張與凝膠等寬的濾紙，將濾紙縱向自固相支持物垂於轉印跡槽中（簡稱「橋」），底面在上的凝膠，濾膜（與凝膠等大），濾紙（與凝膠等大），吸水紙（略小於濾紙，5－8cm高），400－800g重物。凝膠四周用Parafilm膜包圍防止短路。濾膜事先用2╳SSC浸溼至少5 min。濾紙事先用20╳SSC浸溼。轉膜4－18小時；
注意：轉膜裝置中各層濾紙和膜之間要將氣泡趕淨。一旦建立轉膜系統後，要防止濾膜和凝膠錯位。防止吸水紙倒塌和完全溼透，要及時更換吸水紙。
5、 轉膜結束後，取出濾膜，邊角剪一小角做標記。濾膜於2╳SSC搖洗5min，用濾紙吸乾；6、 用紫外交聯照射（正面朝上）或於80℃烤箱烘烤0.5－2小時；
7、 膜可立即進行預雜交和雜交，或保存於4℃待以後應用；
8、 預雜交和雜交
1） 將雜交膜浸溼於6╳SSC 2min，同時預熱預雜交液和雜交爐至預雜交溫度；
2） 雜交膜封於雜交袋，按0.2ml/cm2膜面積加入預雜交液，預雜交至少1小時；
3） 用於southern blot的探針可分為DNA探針、RNA探針和寡核苷酸探針。對探針的標記方法又可以分為放射性標記和非放射性標記。這裡主要介紹非放射性地高辛標記探針的雜交方法。雜交時各種探針的用量：DNA探針，5－25ng/ml；RNA探針，100ng/ml；寡核苷酸探針，0.1－10pmol/ml。雙鏈DNA探針提前100℃變性10min後迅速冰浴，單鏈探針無需變性。將處理後的探針加入雜交液溫浴至雜交溫度。雜交溫度的選擇根據雜交液的不同而不同；
注意：應用寡核苷酸探針時，雜交溫度的選擇。Tm＝4╳(G C) 2╳(A T),雜交溫度比Tm低約10℃。
4） 棄去預雜交液，將含探針的雜交液注入雜交袋，至少3.5ml/10╳1℃m，置入雜交爐滾動；
9、 雜交後的洗膜處理過程，順序如下：
2×洗液 2×15min
0.5×洗液 2×15min
1×緩衝洗液 1×3min
1×封阻液 1×60min
抗體液* 1×30min
1×緩衝洗液 2×15min
1×檢測液 1×5min
* 抗－地高辛－鹼性磷酸酶用1×封阻液稀釋10，000倍（若用顯色法稀釋5000倍；若用CDP-Star檢測用20，000倍稀釋）；
10、將膜浸於CSPD液（CSPD用1×檢測液稀釋100倍，CDP-Star也用1× 檢測液稀釋100倍）室溫避光靜置 5min；回收剩餘的CSPD液或CDP-Star液避光保存於4℃可反覆應用3－5次；
11、將膜上殘液吸淨，用保鮮膜封好於37℃反應15min，然後將膜固定於壓片夾，進行曝光。
注意：若用顯色劑檢測，新鮮配置顯色劑（45μlNBT和35μl BCIP溶於10ml 1×檢測液），將膜浸於顯色劑中避光反應4－16小時，反應期間不要移動膜。

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