Western blot 操作流程
作者：孫雪純
審核人：關寶生
發布者：王建宇
實驗原理：
Western,也稱Western blot、Western blotting、Western印跡，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。Western Blot採用的是聚丙烯醯胺凝膠電泳,被檢測物是蛋白質,「探針」是抗體,「顯色」用標記的二抗。經過PAGE分離的蛋白質樣品,轉移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上,固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質,且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原,與對應的抗體起免疫反應,再與酶或同位素標記的第二抗體起反應,經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛應用於檢測蛋白水平的表達。
內參:
WB過程監測以及目的蛋白定量的標準;最重要和最不可或缺的對照就是內參照。
1.內參可檢測整個WB實驗過程及體系是否正常工作,如果一個實驗連內參照都出不了陽性結果的話（在內參抗體有效的情況下）,那麼這個體系就是存在問題的；
2、起半定量的標準的作用,內參一般選擇管家基因編碼表達的蛋白,在很多組織和細胞中都是穩定表達的,因此可以作為檢測靶蛋白表達量的標準；
內參名稱
分子量大小
適用範圍
beta-actin
43kDa
胞漿和全細胞
GAPDH
30-40kDa
胞漿和全細胞
Tubulin
55kDa
胞漿和全細胞
VCDA1/Porin
31kDa
線粒體
COXIV
16kDa
線粒體
TBP
38kDa
細胞核
實驗步驟
一、蛋白樣品製備（組織中總蛋白的提取）
第一步：
法（1）敲取0.07-0.1g組織+400-500ul裂解液，放入打樣管，放入打樣機打樣。
法（2）實驗室研缽研磨：取稍大於0.1g的樣品放入研缽中，來回磨，至粉末狀，用槍頭刮取收集入離心管。
註：任何操作都要在液氮中進行，並且要將槍頭和離心管提前泡在液氮中。
第二步：取出的樣品放置冰上1-2h（中間混勻5-6次）直至裂解完全。
第三步：樣品離心*2，取上清於新的EP管中。
（離心條件：13000rpm，4℃，30min）
註：離心機提前預冷至4℃。
二、蛋白含量的測定
第一步：在96孔板第一列1-8分別為濃度為0,1,2,4,6,8,9,10倍的蛋白標準液+水=10或20ml，再加上5倍稀釋的考馬斯亮藍染液200ml。
第二步：在96孔板後面幾列依次加入稀釋的蛋白樣品或原液10-20ml以及5倍稀釋的考馬斯亮藍染液200ml。
註：原液濃度太高時進行稀釋，用裂解液稀釋。
三、電泳
第一步：清洗玻璃板
第二步：配膠
（1）玻璃板對齊後放入夾中卡緊,然後垂直卡在架子上準備灌膠。
（2）配分離膠，加入TEMED後立即搖勻即可灌膠。待膠面升到玻璃板3/4位置時即可。然後膠上加一層水，液封后的膠凝的更快。
註：加水液封時要很慢，否則膠會被衝變型。
（3）當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。倒去膠上層水並用吸水紙將水吸乾。配濃縮膠，加入TEMED後立即搖勻即可灌膠。將剩餘空間灌滿濃縮膠然後將梳子插入濃縮膠中。待到濃縮膠凝固後，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。
註：插梳子時要使梳子保持水平。
（4）用水衝洗一下濃縮膠，將其放入電泳槽中。（小玻璃板面向內，大玻璃板面向外。若只跑一塊膠，槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。）
第三步：上樣
（1）測完蛋白含量後，計算含50mg蛋白的溶液體積即為上樣量。適量蛋白加入4：1 5*Loading Buffer於離心管，100℃水中煮5min使蛋白變性。放置冰上3min，離心15min，13000rpm，4℃。
（2）加足夠的1*電泳緩衝液後開始準備上樣。（電泳液至少要漫過內測的小玻璃板。）用微量進樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。（加樣太快可使樣品衝出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。）
第四步：電泳
濃縮膠80V電壓跑20分鐘，可多跑幾分鐘；分離膠180V電壓跑至底端。
第五步：停止電泳
純水衝洗玻璃板，取膠，清洗切去濃縮膠，在Marker下方切角做標記，將膠泡在清水中。
四、轉膜（跑膠時準備轉膜用品,最主要趕氣泡）
第一步：剪PVDF膜,並提前切個角，甲醇中泡2-3min。
第二步：將膜、海綿、濾紙一起泡入1*轉膜液中，放4℃保存。
註：轉膜液可回收。
第三步：將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，用玻棒來回擀幾遍以擀走裡面的氣泡。(一手擀另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。)在墊子上墊2層濾紙，一手固定濾紙一手用玻棒擀去其中的氣泡。將膠蓋於濾紙上，輕輕用玻棒擀去氣泡。將膜用鑷子蓋於膠上，並除氣泡。在膜上蓋2層濾紙並除去氣泡。最後蓋上另一個海綿墊，合起夾子。整個操作在1*轉膜液中進行，要不斷的擀去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸後會發生短路。
第四步：將夾子放入轉膜槽槽中，黑對黑,對紅。電轉移時會產熱，過熱有可能造成蛋白質的降解，同時大量產熱，會使凝膠膨脹，有可能在膠和膜之間產生空隙，引起轉膜不均勻，所以在轉膜槽中放入冰盒，在冰水混合物中進行轉膜。
註：轉膜條件是電流300mA或電壓70V，2h；另一個約束條件就是電壓必須控制在60-70V，調節電流。
第五步：轉完後將膜放入裝水的小盒中衝洗，倒水後，加5%的封閉液，搖床封閉1h。
五．抗體孵育,免疫反應
第一步：回收封閉液,加入一抗,搖床30min-1h，4℃過夜,再孵育30min-1h。
第二步：一抗回收，用PBST洗，洗5次，每次5min。（少時多次）
第三步：加二抗，孵育2h。
第四步：二抗回收，用PBST洗，洗5次，每次5min。（少時多次）
第五步：純水衝洗5-7次，倒掉純水，加化學發光，膜在化學發光中浸泡2-3min，成像。
實驗藥品試劑
1.裂解液：
母液（動物組織蛋白提取Buffer）：蛋白酶抑制劑：Pmsf（配）=100:1:1
母液常溫放置；蛋白酶抑制劑和Pmsf需-20℃保存；裂解液需-4℃保存。
2.考馬斯亮藍染液，使用前用無菌水稀釋。
3.轉膜液的配製（1*）1L
試劑
劑量
Tris
3.028g
Glaline（甘氨酸）
14.4g
SDS
1g
先定容800ml，調製PH=8.3，然後+200ml甲醇，混勻。
4.蛋白電泳Buffer（5*）1L
試劑
劑量
Tris
15g
Glaline（甘氨酸）
72g
SDS
5g
直接定容至1L，無需滅菌和調PH；使用前稀釋至1*。
5.磷酸鹽緩衝液（PBS，10*）500ml
試劑
劑量
NaCl
40g
KCl
1g
Na2HPO4·2H2O
7.2g
KH2PO4
1.2g
調製PH=7.4-7.5
6.PBST配製
1L的PBS+5ml 20%Tween20
7.封閉液（5%）
奶粉5g，溶於PBS，定容至1L。
註：推薦使用的奶粉：雀巢高鈣奶粉或多力精低脂奶粉。
8.一抗溶於封閉液；二抗溶於PBST。
9.按照如下表格配製SDS-PAGE的濃縮膠(也稱堆積膠、積層膠、上層膠)
成分
配製不同體積SDS-PAGE濃縮膠所需各成分的體積（mL）
5%膠
2
3
4
6
8
10
蒸餾水
1.4
2.1
2.7
4.1
5.5
6.8
30%Acr-Bis(29:1)
0.33
0.5
0.67
1.0
1.3
1.7
1M Tris,pH8.8
0.25
0.38
0.5
0.75
1.0
1.25
10%SDS
0.02
0.03
0.04
0.06
0.08
0.1
10%過硫酸銨
0.02
0.03
0.04
0.06
0.08
0.1
TEMED
0.002
0.003
0.004
0.006
0.008
0.01
10.根據目的蛋白的分子量大小選擇合適的分離膠（下層膠）濃度
SDS-PAGE分離膠濃度
最佳分離範圍
6%膠
50-150kD
8%膠
30-90kD
10%膠
20-80kD
12%膠
12-60kD
15%膠
10-40kD
成分
配製不同體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）
6%分離膠
5
10
15
20
30
50
蒸餾水
2.0
4.0
6.0
8.0
12.0
20.0
30%Acr-Bis(29:1)
1.0
2.0
3.0
4.0
6.0
10.0
1M Tris,pH8.8
1.9
3.8
5.7
7.6
11.4
19.0
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
10%過硫酸銨
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
TEMED
0.004
0.008
0.012
0.016
0.024
0.04
成分
配製不同體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）
8%分離膠
5
10
15
20
30
50
蒸餾水
1.7
3.3
5.0
6.7
10.0
16.7
30%Acr-Bis(29:1)
1.3
2.7
4.0
5.3
8.0
13.3
1M Tris,pH8.8
1.9
3.8
5.7
7.6
11.4
19.0
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
10%過硫酸銨
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
TEMED
0.003
0.006
0.009
0.012
0.018
0.03
成分
配製不同體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）
10%分離膠
5
10
15
20
30
50
蒸餾水
1.3
2.7
4.0
5.3
8.0
13.3
30%Acr-Bis(29:1)
1.7
3.3
5.0
6.7
10.0
16.7
1M Tris,pH8.8
1.9
3.8
5.7
7.6
11.4
19.0
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
10%過硫酸銨
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
TEMED
0.002
0.004
0.006
0.008
0.012
0.02
成分
配製不同體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）
12%分離膠
5
10
15
20
30
50
蒸餾水
1.0
2.0
3.0
4.0
6.0
10.0
30%Acr-Bis(29:1)
2.0
4.0
6.0
8.0
12.0
20.0
1M Tris,pH8.8
1.9
3.8
5.7
7.6
11.4
19.0
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
10%過硫酸銨
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
TEMED
0.002
0.004
0.006
0.008
0.012
0.02
成分
配製不同體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）
15%分離膠
5
10
15
20
30
50
蒸餾水
0.5
1.0
1.5
2.0
3.0
5.0
30%Acr-Bis(29:1)
2.5
5.0
7.5
10.0
15.0
25.0
1M Tris,pH8.8
1.9
3.8
5.7
7.6
11.4
19.0
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
10%過硫酸銨
0.05
0.1
0.15
0.2
0.3
0.5
TEMED
0.002
0.004
0.006
0.008
0.012
0.02