Western Blot (免疫印記法)常識問答

　　1. 什麼是western blot?

　　答：WB又稱免疫印記法.是將生物大分子物質通過不同途徑轉移到固相載體的過程。

　　2. western blot 有什麼優點?

　　答：靈敏，可達ng級，用Ecl顯色法理論上可達pg 級。方便，特異性高。

　　3. western blot 的具體步驟是什麼?

　　答：一. 制樣(以提動物組織總蛋白為例)，

　　1) 組織洗滌後加入3 倍體積PBS，0℃研磨。

　　2) 加入5×STOP buffer

　　3) 180W, 6mins，0℃超聲波破碎

　　4) 5000rpm，5mins 離心，取上清。

　　5) 加入REB(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍(9.5ml加入0.5ml)

　　6) 煮沸，10min

　　7) 分裝，於-20℃保存，用時取出，直接溶解上樣。

　　二. 電泳(SDS-PAGE)

　　建議欲檢測抗原10-30kd, 用15%膠;30-100kd, 用10%膠;100-200kd，用7.5

　　%膠。

　　1)配膠(one piece)A.分離膠。單位：ml。Total: 8ml

　　7.5% 10% 15%

　　2×Sep. buffer 4 4 4

　　30% Gel.sol 2.0 2.7 4

　　ddH2O 1.9 1.2 0

　　TEMED 8ul 8ul 8ul

　　10%APS 80ul 80ul 80ul

　　B. 濃縮膠。單位：ml。Total: 3.5ml

　　3%

　　2×Stacking. buffer 1.7

　　30% Gel.sol 0.35

　　ddH2O 1.4

　　TEMED 5ul

　　10%APS 50ul

　　2)點樣。上樣蛋白量不應超過30ug/mm2. (載荷面即：如果你的膠槽是5mm×1mm, 則

　　載荷面為：1mm×5mm=5mm2)

　　3)電泳。開始用80V電壓，但是當溴酚藍至分離膠時，用100-120V電壓。

　　4)轉移(一塊膠)。

　　A.半乾法。

　　a. 取六張濾紙(Bio-Rad，1mm)，三張做上層濾紙，三張做下層。其中，

　　上層濾紙一定要比較乾淨，無汙染。用前都用Transfer buffer 浸泡至少

　　五分鐘。

　　b. 準備硝酸纖維素薄膜，用時先用甲醇浸泡1-3min.倒掉後，再用Transfer

　　buffer 浸泡。

　　c. 做三明治。陽極上鋪三張下層濾紙，再浸泡過的膜，再鋪膠，然後鋪三

　　實驗方法互助區——蛋白區

　　張上層濾紙，最後鋪上三張上層濾紙，蓋上陰極。注意每層之間不能有

　　氣泡。膜上用鉛筆畫出膠的邊緣。標上下。

　　d. 轉移，0.8mA/cm2-3mA/cm2. 經驗是：100kd-200kd，用2mA/cm2，2hrs;

　　30-100kd用1.0-2.0mA/cm2，40mins-1.5h;10kd-30kd%用0.5-0.8mA/cm2，

　　15mins-40mins.

　　B.溼法。

　　a. 取四張濾紙，兩張做上層濾紙，兩張做下層。其中，上層濾紙一定要比較

　　乾淨，無汙染。

　　b. 準備硝酸纖維素薄膜，用時先用甲醇浸泡1-3mins.倒掉後, 再用Transfer

　　buffer 浸泡。

　　c. 做三明治。

　　e. 轉移。抗原≥100kd, 先28V轉移1h, 然後84V轉移14-16h, ≤100kd， 則

　　63V轉移4-16h.

　　三 封閉：5%牛奶4℃封閉過夜，或RT 1hr.

　　四 第一步反應：5%牛奶或2%BSA稀釋抗體(稱一抗)，稀釋比例按抗體說明,室溫

　　孵育1hr，

　　五 洗滌：TBST 洗5 mins 3-5 次。

　　六 第二步反應：將膜跟5%牛奶或2%BSA稀釋的2 抗一起孵育，室溫1hr。

　　七 洗滌：TBST 洗5 mins 3-5 次。

　　八 顯色：

　　4. western blot 所需buffer 的配方是什麼?

　　答：主要的buffer有：

　　1) 2×Separation buffer (PH: 8.8)

　　0.75M TRIS.HCl 90.825g

　　0.2% SDS 10ml 20% SDS

　　Total: 1000ml

　　2) 30% gel Solution

　　0.8% kis-aciylamide 0.8g

　　29.2% aciylamide 29.2g

　　Total: 100ml

　　3)10% APS: 0.1g 溶於1.0ml ddH2O.

　　4) 2×Stacking buffer(PH: 6.8)

　　0.2M Tris 15.14g

　　0.2% SDS 1g or 5ml 20% SDS

　　Total: 500ml

　　5) 10×Running buffer(PH: 8.3)

　　250mM Tris 60.55g

　　1.9M Glycine 285.27g

　　1% SDS 20g or 100ml 20% SDS

　　Total: 2 liters

　　6) Semi-dry transfer buffer(PH:8.3):

　　48mM Tris 5.8g

　　39mM Glycine 2.9g

　　0.037% SDS 0.37g

　　實驗方法互助區——蛋白區

　　20% MeOH 200ml

　　Total: 1000ml

　　7) Wet transfer buffer 1(PH: 8.3): (20-400kd)

　　50mM Tris 5.8g

　　380mM Glycine 29g

　　0.1% SDS 1.0g

　　20% MeOH 200ml

　　Total: 1000ml

　　8) Wet transfer buffer 2(PH: 8.3) <80kd

　　25mM Tris 5.8g

　　190mM Glycine 29g

　　20% MeOH 200ml

　　Total: 1000ml

　　9) blocking buffer:

　　5% milk 5g

　　TBST 100ml

　　※：奶粉為脫脂奶粉。

　　10) 10×TBS (PH: 7.6)

　　NaCl 80g

　　Tris 30g

　　Total: 1000ml

　　11) TBST (PH: 7.4)

　　NaCl 25mM

　　Tris 100Mm

　　Tween-20 0.2%

　　Total: 1000ml

　　12) 5×STOP buffer (PH: 6.7)

　　20% Glycerol 100ml

　　10% SDS 50g

　　250mM Tris 15.14g

　　用時取9.0ml，加入0.5ml β-ME和0.5ml 溴酚藍，可製成sample buffer。

　　5. western blot 常見問題有那些?

　　1) 為什麼我的細胞提取液中沒有目標蛋白?

　　答：原因有很多，1 你的細胞中不表達這種蛋白質，換一種細胞;2 你的細胞中的蛋白質被降解掉了，你必需加入PMST，抑制蛋白酶活性;3 你的抗體不能識別目標蛋白，多看看說明，看是否有問題。

　　2)我的細胞提取液有的有沉澱，有的很清亮，為什麼呢?

　　答：1 有沉澱可能是因為你的蛋白沒有變性完全，可以適當提高SDS 濃度，同時將樣品煮沸時間延長，2 也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量sample buffer即可。

　　3)我做的蛋白質分子量很小(10KD)，請問怎麼做WB?

　　答：可以選擇PSQ 膜，同時縮短轉移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再轉移。其

　　他按步驟即可。

　　4)我的目的帶很弱，怎麼加強?

　　答：可以加大抗原上樣量。這是最主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。

　　實驗方法互助區——蛋白區

　　5)膠片背景很髒，有什麼解決方法?

　　答：減少抗原上樣量，降低一抗濃度，改變一抗孵育時間，牛奶濃度提高。

　　6)目標帶是空白，周圍有背景，是為什麼?

　　答：你的一抗濃度較高，二抗上HRP 催化活力太強，同時你的顯色底物處於一個臨界點，反應時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白。將一抗和二抗濃度降低，或更換新底物。

　　7)我的膠片是一片空白，是怎麼回事?

　　答：如果能能夠排除下面的幾個問題那麼問題多半出現在一抗和抗原製備上。

　　1 二抗的HRP 活性太強，將底物消耗光;2 ECL底物中H2O2，不穩定，失活;3 ECL

　　底物沒覆蓋到相應位置;4 二抗失活。

　　8)問我顯影液顯影1分鐘,和5分鐘後,底片漆黑一片,是什麼原因呢?

　　答：1可能是紅燈造成的,可以在完全黑暗的情況下操作.看是否有改善.

　　膠片本來就被曝光了2顯影時間過長.

　　9)DAB好還是ECL好?

　　答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物;

　　ECL結果容易控制，但被催化時靈敏度差一點，但如果達到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。要看你實驗的情況。

　　10)抗原分子量是資料上的兩倍，是怎麼回事?

　　答：抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時間延長，可以打開二聚體。在上層膠中加入尿素至8M也可以打開。

　　11)半乾轉是否要求膜，濾紙，膠同樣大小?

　　因為膠大小不一定規則，膜和濾紙會大一點，那樣會不會短路?

　　什麼是短路?如何控制和發現短路呢?

　　答：一般參照膜>= 濾紙> 膠, 就行，

　　你轉移前和轉移過程中看看電壓就行，正常的半乾是慢慢變高的， 最後結束時一般是開始的1.5-3倍都是正常的。一般Buffer和濾紙選的對就不會短路。

　　12)電泳時Marker 按說明加5ul，但電泳中看不見，是失活了嗎?

　　答：加入20ul即可。

　　13)蛋白轉移不到膜上，但膠上有，同時Marker 轉上去了，為什麼了?

　　答：可能是1樣品濃度過低2轉移時間不夠，。

　　14) 我的一抗量較少，同時我也不知道一抗的最佳稀釋比例是多少，怎麼做呢?

　　答：確定實驗過程無汙染後，將含抗體的稀釋液回收，保存於-70℃。最好第一次的濃度做高一點，這樣，如果結果不好，可以嘗試再稀釋。