免疫印跡（Western Blot） 採用的是聚丙烯醯胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，「探針」是抗體，「顯色」用標記的二抗。SDS-PAGE 可對蛋白質樣品進行分離，轉移到固相載體——例如硝酸纖維素薄膜（NC）上。固相載體可以吸附蛋白質，並保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。轉移後的 NC 膜就稱為一個印跡（blot），用蛋白溶液（如 5%BSA 或脫脂奶粉溶液）處理，封閉 NC 膜上的疏水結合位點。用目標蛋白的抗體（一抗）處理 NC 膜——只有待研究的蛋白質才能與一抗特異結合形成抗原抗體複合物，這樣清洗除去未結合的一抗後，只有在目標蛋白的位置上結合著一抗。用一抗處理過的 NC 膜再用標記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠中獲得的，則二抗就是抗鼠IgG 的抗體。處理後，帶有標記的二抗與一抗結合形成抗體複合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質的位置。
使待測樣品中的蛋白質按分子量大小在凝膠中分成帶。
1. Western blot 結果中的背景為什麼較高?
可能的原因及建議
1) 膜封閉不夠——延長封閉的時間；選擇更加適合的封閉液。Abcam 推薦 5% 脫脂奶粉、3% BSA 或血清封閉 30 分鐘。這些可以包含在抗體緩衝液中。
2) 一抗稀釋度不適宜——對抗體進行滴度測試，選擇最適宜的抗體稀釋度。
3) 一抗孵育的溫度偏高——建議 4℃結合過夜。
4) 膜在實驗過程中幹過——實驗過程中要注意保持膜的溼潤。
5) 檢測時曝光時間過長——減少曝光時間。
6) 二抗與封閉劑非特異性結合或反應——設置二抗對照(不加一抗)。
7) 一抗或二抗與封閉劑有交叉反應——在孵育和洗滌液中加入溫和去汙劑如吐溫 -20。脫脂奶粉含有酪蛋白，該蛋白本身就是一種磷酸化蛋白，會結合磷酸化特異性抗體而易產生 高背景。使用 BSA 代替奶粉作為封閉劑。
8) 未結合蛋白質洗滌不充分——增加洗滌次數。
9) 膜的選擇導致的高背景——NC 膜比 PVDF 膜背景低。
可能的原因及建議
目的蛋白有多個修飾位點（磷酸化位點、糖基化位點、乙醯化位點等），本身可以呈現多條帶。查閱文獻或進行生物信息學分析，獲得蛋白序列的修飾位點信息，通過去修飾確定蛋白實際大小。
目的蛋白有其它剪切本——查閱文獻或生物信息學分析可能性。
樣本處理過程中目的蛋白發生降解——加入蛋白酶抑制劑；樣本處理時在冰上操作。
上樣量過高，太敏感——適當減少上樣量。
一抗特異性不高——重新選擇或製備高特異性的抗體。
一抗不純——純化抗體
一抗或者二抗濃度偏高——降低抗體濃度。
細胞傳代次數過多，使其蛋白表達不同——使用原始未傳代的細胞株，和現在的細胞株一起做平行對照實驗。
檢測到未經報導過的新蛋白或同一蛋白家族中具有相似表位而結構不同的蛋白——查閱其它文獻報導，或 BLAST 搜尋，使用說明書推薦的細胞株或組織。
條帶為非特異性條帶——應用封閉多肽來區分特異性和非特異性條帶，只有特異性條帶能被封閉從而消失。
靶蛋白形成多聚體——SDS-PAGE 電泳上樣前，煮沸 10 分鐘而不是 5 分鐘，使蛋白質解聚。
結果中無信號或顯示信號弱可能的原因及建議
1) 檢測樣本不表達目的蛋白——選擇表達量高的細胞作為陽性對照，用於確定檢測樣本是否為陰性。
2) 檢測樣本低表達目的蛋白——提高上樣量，不 低於20-30ug，裂解液中注意加入蛋白酶抑制劑。
3) 轉移不完全或過轉移——可以用麗春紅染膜並結合染膠（考馬斯亮藍）後確定條帶是否轉至膜上或轉移過頭；適當調整轉膜的時間和電流。
4) 抗體不能識別測試種屬的相關蛋白——購買抗體前應當認真閱讀抗體說明書，確定其是否能夠交叉識別測試種屬的對應蛋白。
5) 一抗孵育時間不足或一抗不足或一抗失效——建議 4℃結合過夜，使用高濃度抗體，使用新鮮抗體，重複使用有效濃度會降低。
6) 二抗與一抗不匹配——選擇針對一抗來源的種屬的抗體。
7) 洗膜過度——洗膜時間不宜過長，加入的去垢劑不宜過強或過多，建議使用 0.1%的弱去垢劑 Tween-20。
8) 封閉劑和一抗或二抗有交叉反應——使用使用溫和的去汙劑如吐溫-20，或更換封閉劑（常用的脫脂奶粉、BSA、血清或明膠）。
9) 二抗受疊氮鈉抑制——避免疊氮鈉和 HRP 標記抗體一起使用。
1) 膜上多處出現黑點或黑斑——抗體與封閉試劑發生非特異性的結合，過濾封閉劑。
2) 反白（條帶顯白色）——目的蛋白含量太高或者一抗濃度偏高，稀釋抗體的濃度。
3) 蛋白分子量偏低或偏高——膠濃度不適合，高分子量要用低濃度膠；小分子蛋白要用高濃度膠。
4) 分子量蛋白標準條帶呈黑色——抗體和分子量蛋白標準發生了反應，在分子量蛋白標準和第一個樣品之間增加一個空白條帶。
5) 目的條帶染色過低/過高——分離不徹底，改變凝膠比例：分子量大的蛋白用低濃度膠，分子量小的蛋白用高濃度膠。
6) 相同的蛋白雜交出現大小不均勻條帶——製備凝膠時凝膠凝固太快，致使泳道中丙烯醯胺的比例不均勻，參照凝膠的配方，在凝膠中加入適量 TEMED，放置時在凝膠頂部加入適量 0.1% SDS（水稀釋）以防凝膠變幹。
1) 遷移速度過快——降低電泳電壓。
2) 電泳溫度過高（改變了 pH 值和遷移速度）——降低遷移速度或低溫電泳(冷庫或冰上)。
1) 細菌汙染——4°C 保存抗體並使用新鮮的緩衝液浸泡凝膠。
2) 抗體量不足——確保在振蕩孵育時抗體充分浸沒膜。
PBS 的緩衝能力強於 TBS（因為混合緩衝液在一定的離子強度下常常具有更寬的緩衝範圍），TBS 在 PH7.0 以下緩衝能力較弱（不過 PBS 易汙染）。但我們常常要根據我們實驗目的選用合適的緩衝液，如在蛋白純化中進行陰離子交換層析，陽離子緩衝液首選 TBS；陽離子交換層析時，陰離子緩衝液則首選 PBS。
Western blot 中使用 TBS 和 PBS 均可，只是要根據需要選擇合適的濃度。
通常情況下只加一種一抗。做 Western 在同一張膜上檢測目的蛋白和內對照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL 顯色、壓片、洗片；漂洗以後，再上內對照的一抗、二抗，ECL 顯色、壓片、洗片。
PVDF 膜價格較貴，可重複使用，但結合能力較強。
NC 膜價格比較便宜，應用較廣，結合牢固性較 PVDF 膜差，韌性也不如 PVDF，不能重複使用，但蛋白吸附容量高，親水性較好。
9. Western 一抗的選用
理論上單抗比多抗的特異性要好，但單抗種類較少一般價格偏高，所以一般來說多抗足夠了。
一般來說用於 western 的抗體主要識別胺基酸序列特異性；而可用於 ELISA 的抗體則要看抗原種類，有些是識別胺基酸序列特異性，有些是識別構像特異性。所以一般根據抗體說明書來確定。
做免疫印跡時選擇抗體主要應考慮兩個問題，一是所選抗體是否能識別凝膠電泳後轉印至膜上的變性蛋白，另一個是所選抗體是否會引起交叉反應條帶。
如果紙、膜比凝膠大就比較容易形成短路了，上下兩層慮紙也不能因過大而相互接觸，這樣同樣會短路，電流不會通過膠和慮紙。轉移前和轉移過程中看看電壓就行，正常的半乾是慢慢變高的，最後結束時一般是開始的 1.5-3 倍都是正常的。一般 Buffer 和濾紙選的對就不會短路。
1) 陰離子染料是較常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測極限可達到 1.5μg，考馬斯亮藍雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅 S 和快綠在檢測後容易從蛋白質中除去，以便進行隨後的胺基酸分析。缺點是：溶劑系統的甲醇會引起硝化纖維素膜的 皺縮或破壞。不能用語正電賀的膜。靈敏度低。
2) 膠體金，靈敏度高，檢測範圍可到 pg 級，但染色比穩定。
3) 生物素化靈敏度位於 1、2 之間，可用於任何一種膜。
可以在轉移緩衝液中加入 20%甲醇（是指終濃度），因為甲醇能增加蛋白質和 NC 膜的結合能力，同時可以延長高分子量蛋白質轉移時間；轉移緩衝液加入終濃度 0.1% SDS，也是為了增加轉移效率；選用優質的轉移膜，或使用小孔徑的 NC 膜（0.2 微米）；使用戊二醛交聯。太大時還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉移電壓／電流；增加轉移時間。
14. DAB 顯色、鹼性磷酸酶-抗鹼性磷酸酶顯色原理DAB 顯色在辣根過氧化酶的作用下能形成一種灰褐色的產物，該產物難溶於醇和其他有機溶劑，DAB 的氧化還能引起聚合作用，導致與四氧化鋨反應而增加其染色強度和電子密度。鹼性磷酸酶-抗鹼性磷酸酶顯色中，酶將奈酚磷酸（底物）水解成酚類和磷酸。酚和無色的重氮鹽（顯色原）結合而產生有色的、不溶性偶氮染料。
免疫酶技術就是用酶標記已知抗體（或抗原），然後與組織標本在一定條件下反應並結合，結合形成的複合物中所含有的酶分子遇到底物時，會催化底物水解、氧化或還原，從而發生顯色反應。免疫酶組化技術分為酶標記法與非標記抗體技術，前者是將酶通過交聯劑結合在抗體分子上，形成酶標記抗體。後者是將酶作為抗原與相應的特異性抗體連接進行的免疫反應，稱為非標記抗體酶技術。
免疫螢光技術中的螢光抗體染色標本不能長期保存，對組織細胞的細微結構分辨不清，但免疫酶技術則能克服上述不足，標記免疫酶技術的敏感性更優於免疫螢光法。酶顯色產物具有較高的電子密度，經過適當處理還可以進行免疫電鏡觀察。
蛋白質印跡是一種基於蛋白質大小來分離蛋白質的技術。一般來講，蛋白質越小，在膠上的遷移速度越快。但遷移速度也受其它因素的影響，因此，觀察到的實際條帶大小可能與預測的不同。常見的因素包括：
1) 翻譯後修飾 - 例如磷酸化、糖基化等，可增加蛋白質大小。
2) 翻譯後切割 - 例如，許多蛋白先被合成為前蛋白，然後被切割產生活性形式，例如前半胱天冬酶。
3) 剪接變體和異形體 - 可變剪接和異形體可能從同一基因產生不同大小的蛋白質。
4) 相對電荷-胺基酸（帶電和不帶電）多聚體組分，例如蛋白質的二聚化。這種情況通常在還原條件下需要防止，但強相互作用會導致較大的條帶出現。
細胞裂解物、膜裂解物和核裂解物：每孔上樣 20 至 30 µg 總蛋白。
這可能需要根據測試樣品中的蛋白質表達水平進行一些優化。純化蛋白（重組或內源）：上樣 10 至 100 ng 蛋白。
抗體檢測重組蛋白質時，存在難以克服的困難，有必要加以考慮。我們推薦確保樣品中表達的重組蛋白包含所用抗體的免疫原序列。
同時，如果重組蛋白帶有標籤，標籤可能阻止抗體接近表位。儘可能讓標籤位於重組蛋白的 C 或 N 末端，以降低這種情況發生的可能性（而不是位於蛋白質的閱讀框中間）。
在蛋白質印跡中檢測重組蛋白時，我們始終推薦運行內源陽性對照。
我們推薦查看數據表獲取更多詳情。Abcam 抗體將僅在還原和變性條件下進行測試，除非數據表中另有說明，我們推薦使用還原和變性條件。
在一些情況下，Abcam 抗體也將在非還原條件下進行測試，在這種情況下，我們將在數據表上詳細說明（參見應用備註部分或 Abreviews）。如果我們有表明抗體在某種或其它條件下無效的數據，數據表會加以說明。
抗體可能對封閉劑敏感，我們推薦查看數據表確定是否有數據表明抗體在 BSA 還是牛奶中效果更好。如果有，Abcam 將在數據表中加以說明。
一般來講，BSA 會產生更清晰的結果，因為 BSA 含有較少的蛋白，因而抗體較少與其發生交叉反應。但並非總是如此，有些抗體在牛奶中的效果更好，因為牛奶含有更多種類的封閉蛋白，能封閉更多不同類型的蛋白質。
蛋白質印跡中一抗孵育時間需要最終用戶進行優化。一般來講，4 ℃ 過夜孵育將產生更高效、更特異的染色。但許多抗體在室溫下孵育 1 或 2 小時效果也非常好。
我們推薦查看數據表上關於合適孵育時間的數據（參見可用的Abreviews、出版物和圖像數據）。
22. WB不建議分裝抗體，可能會導致抗體失效；
四、參考來源：
1. http://www.detaibio.com/material-western-blot-faq.html
2. https://www.abcam.cn/products?keywords=westernblot